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背景:转移是肿瘤引起死亡的主要原因,而基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在肿瘤微环境和转移过程中发挥关键性作用,现有研究表明MMP-9蛋白的高表达会促进人类乳腺癌的转移。另有报道称在犬乳腺肿瘤(CMT)中MMP-9对肿瘤的发生发展也有促进作用。理论上讲胶原酶抑制剂可以抑制肿瘤的转移。本研究目的为从多种小分子药物中筛选出抑制MMP-9的抑制剂,考察该分子在体外对肿瘤细胞的抑制作用,在体内对肿瘤的形成以及转移的抑制作用,并且分析药物发挥作用的机制。为之后临床用药提供依据,并部分揭示肿瘤转移的机理。方法:MMP-9蛋白在CMT中的表达量由免疫组化(IHC)方法测定,同时对肿瘤组织使用H&E染色进行病理学判读。使用体外酶活抑制试验以及计算机分子对接技术从37种小分子中草药提取物中进行MMP-9抑制剂的筛选。培养MDA-MB-231人类乳腺癌细胞系和4T1小鼠乳腺癌细胞系,通过细胞增殖抑制试验、克隆形成试验、划痕试验、明胶酶谱分析以及蛋白免疫印迹检测PMS处理细胞后两个细胞系的增殖、迁移和转移能力,此为细胞层面试验。使用4T1细胞系对BALB/c小鼠进行荷瘤试验,考察大车前苷(PMS)在体内的抗肿瘤作用,通过IHC方法检测相关因子探究PMS发挥作用机制。结果:1.本研究对犬乳腺肿瘤组织样本中MMP-9的表达程度是通过免疫组织化学方法进行检测的,结果发现恶性CMT的MMP-9高表达(70.6%),显著高于其在正常组织和良性CMT中的表达。同时与恶性CMT的核分级、浸润性生长和淋巴结侵袭正相关,即与肿瘤的恶性程度和转移呈正相关,从而提出MMP-9是促进CMT向恶性发展的重要因素之一。2.成功筛选出的大车前苷,极显著降低了 MMP-9蛋白的酶活性(P<0.01)并且能与MMP-9分子对接结合(结合自由能为-10.39 kcal/mol)。浓度为250 μg/m的PMS显著降低了 MDA-MB-231和4T1细胞系的增殖,浓度为100 μg/mL的PMS显著抑制两细胞系的克隆形成。250 μg/mL PMS作用36h,伤口愈合抑制率分别为MDA-MB-231 79.3(±8.2)%,4T1:56.4(±4.2)%与对照组差异极显著(P<0.01)。PMS抑制肿瘤细胞的侵袭是剂量依赖性的,浓度越高,抑制作用越强。在PMS处理细胞后,在加入外源MMP-9,细胞可以恢复原有的侵袭能力。明胶酶谱分析试验结果显示,两个细胞系的MMP-9活性显著降低。而从免疫蛋白印记试验结果可以看出,PMS并不会影响MMP-9蛋白的表达量。3.PMS抑制4T1荷瘤小鼠肿瘤的生长,PMS显著降低了肿瘤的质量和体积(P<0.05),并且抑制肿瘤向肺部转移,对照组(92.8±11.9)的转移灶显著多于PMS组(29.5 ±8.4),差异为极显著(P<0.01);同时使肺部转移肿瘤灶的增殖能力降低,Ki67的肺部组织IHC染色结果显示对照组为(24.3%± 2.1%),PMS 组为(10.6%± 4.5%)(P<0.05)。血管生成标记物 CD31 和 α-SMA在对照组的表达显著高于PMS治疗组(P<0.01)。结论:MMP-9在犬恶性乳腺肿瘤中高表达,可以作为诊断犬乳腺肿瘤恶性程度的标记分子。PMS在体外通过抑制MMP-9的活性抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力等特性。在体内,PMS抑制MMP-9活性减少血管生成,发挥抗肿瘤作用。