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肥胖是常见的能量代谢性疾病,是引起糖尿病、心脑血管疾病、高血压等多种疾病的危险因素。近年来,肥胖的发生率逐年增高,其中以儿童肥胖发生率的升高尤为突出,已在全球范围内呈流行态势。随儿童肥胖人数的不断增加,各国儿童期2型糖尿病的发病率也逐年增高并已出现明显的低龄化趋势;我国有关肥胖儿童、青少年的研究也发现,肥胖者中目前诊断为2型糖尿病的人数尽管不多,但却普遍存在胰岛素抵抗指数的升高与葡萄糖耐量试验的异常,而胰岛素敏感性降低或胰岛素抵抗是2型糖尿病发生的早期重要事件,因此探讨肥胖及肥胖所致胰岛素抵抗的发病机制也成为儿科研究领域的一个重要研究内容。NYGGF4基因(也称做PID1基因),是本研究小组克隆到的一条人类全长新基因(GenBank登录号AY317148),前期研究已证实该基因差异高表达于肥胖者脂肪组织中,且在骨骼肌、脂肪、心肌等胰岛素作用的靶组织中呈现较高表达;进一步研究还发现该基因的表达随前体脂肪细胞的分化进程逐渐升高,在成熟脂肪细胞中表达最高,且其表达受多种胰岛素敏感性相关因子(如肿瘤坏死因子alpha、白细胞介素6等)的调控,提示该基因可能在成熟脂肪细胞中发挥重要作用,且可能与脂肪细胞胰岛素敏感性的调节相关。因此本文以NYGGF4为研究对象,进一步探讨该基因对胰岛素敏感性的影响并探讨其作用机制。第一部分NYGGF4过表达对脂肪细胞胰岛素敏感性、分泌功能的影响及信号通路分析目的:观察NYGGF4过表达对脂肪细胞胰岛素敏感性、分泌功能的影响及与胰岛素信号通路的关系分析。方法:体外培养稳定转染NYGGF4基因(NYGGF4 - pcDNA3.1)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体(pcDNA3.1)的3T3-L1细胞为对照,胰岛素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导细胞分化成熟。酶联免疫吸附法检测细胞24小时培养上清中肿瘤坏死因子alpha(tumor necrosis factor-alpha,TNFα)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、脂联素(Adiponectin)及抵抗素(Resistin)的水平。应用3H标记的2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy-glucose)检测成熟脂肪细胞在基础状态和胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率。采用Western Blot检测葡萄糖转运体4(GLUT4)的表达及转位;同时检测胰岛素信号转导通路中相关信号分子(IR、IRS-1、AKT、ERK1/2、P38和JNK)的总蛋白水平及磷酸化水平。结果:1)过表达NYGGF4的脂肪细胞其培养上清中TNFα、IL-6、脂联素及抵抗素的分泌水平与对照组相比无显著差异;2)NYGGF4过表达对脂肪细胞基础葡萄糖摄取无影响,但显著降低胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取率;3)NYGGF4过表达抑制胰岛素刺激下的IRS-1、AKT的磷酸化活性,减少GLUT4由胞浆向胞膜的转位;对IR、ERK1/2、P38、JNK的磷酸化活性则无影响。结论:(1)NYGGF4过表达对脂肪细胞的分泌功能无影响;(2)NYGGF4过表达抑制胰岛素信号转导途径中IRS1-PI3K/AKT信号通路的活性,诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗。第二部分NYGGF4过表达影响脂肪细胞胰岛素敏感性的线粒体机制分析目的:探讨NYGGF4过表达影响脂肪细胞胰岛素敏感性的线粒体机制。方法:体外培养稳定转染NYGGF4基因(NYGGF4 - pcDNA3.1)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体(pcDNA3.1)的3T3-L1细胞为对照,胰岛素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导细胞分化成熟。采用电子显微镜观察线粒体形态改变,荧光定量PCR技术检测线粒体DNA的拷贝数;生物发光法检测细胞ATP含量;应用JC-1、DCFDA(2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate,DCFDA)荧光染料预染成熟脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下及流式细胞仪观察线粒体膜电位及细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的变化;进一步采用荧光定量PCR检测线粒体功能相关基因的表达。结果:1)NYGGF4基因过表达的脂肪细胞中线粒体发生皱缩,嵴断裂、减少、消失,部分线粒体肿胀,甚至呈空泡状;2)NYGGF4显著下调成熟脂肪细胞中线粒体DNA的拷贝数;3)NYGGF4基因过表达抑制脂肪细胞中ATP的合成水平;4)NYGGF4基因过表达的脂肪细胞中ROS的水平明显增高,线粒体膜电位呈下降趋势;5)NYGGF4基因过表达脂肪细胞中,线粒体UCP2、UCP4的mRNA水平显著高于对照空载脂肪细胞;6)NYGGF4基因过表达对NRF1、mtTFA mRNA水平无显著影响;但显著增加PGC1α、PGC1β水平;7)NYGGF4基因过表达可致脂肪细胞Mfn1的mRNA表达增高,轻度下调Fis1的mRNA水平,对Mfn2、Drp1表达无显著影响。结论:NYGGF4基因过表达可致脂肪细胞线粒体的形态异常和功能损伤,线粒体功能障碍可能是NYGGF4致胰岛素敏感性降低的重要机制之一。第三部分NYGGF4基因沉默对脂肪细胞胰岛素敏感性及线粒体的影响目的:探讨NYGGF4基因沉默对脂肪细胞胰岛素敏感性及线粒体功能的影响。方法:体外培养稳定转染NYGGF4表达沉默质粒的3T3-L1前体脂肪细胞,经MIX、地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,3H标记的2-脱氧葡萄糖检测成熟脂肪细胞在基础状态、胰岛素、及胰岛素联合PI3K抑制剂(LY294002)刺激下的葡萄糖摄取率;同时观察NYGGF4基因沉默对脂肪细胞线粒体的影响,具体方法同第二部分所述。结果:1)抑制NYGGF4基因的表达增加了3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖摄取率;2)NYGGF4基因沉默通过激活PI3K激酶的活性,促进了3T3-L1脂肪细胞胰岛素刺激状态下对葡萄糖的摄取;3)NYGGF4基因沉默对线粒体的形态及数目无明显影响;4)NYGGF4基因沉默降低脂肪细胞ATP合成能力;5)NYGGF4基因沉默脂肪细胞的ROS产生增多,线粒体膜电位呈上升趋势;6)NYGGF4基因沉默上调促线粒体分裂因子Fis1的表达,对所检测的其他线粒体相关基因的表达无明显影响。结论:NYGGF4基因沉默通过激活PI3K信号通路的活性提高脂肪细胞的胰岛素敏感性;但该基因沉默也引起线粒体出现一定程度的功能损伤,提示NYGGF4在维持线粒体正常功能方面可能起作用。