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内质网是一种重要的真核细胞器,它是分泌性蛋白质及膜蛋白正确折叠及聚合的场所,还是细胞内重要的钙离子贮存库,糖蛋白的糖基化也开始于其中。因此保持内质网稳态是维持细胞生理正常的重要因素。由于葡萄糖或氨基酸饥饿、细胞内钙离子稳态改变以及其他各种原因导致的内质网中蛋白质糖基化或二硫键形成受阻或其它原因会引起内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质的堆积,从而引发未折叠蛋白质反应(unfoldedproteinresponse,UPR),导致内质网应激(ERstress)。处于内质网应激状态的细胞表现出伴侣蛋白基因表达上调、泛蛋白.蛋白酶体途径的基因表达上调、蛋白质合成受抑制等特征。细胞正是通过产生UPR-ERstress减少需要折叠的蛋白质来源,加强蛋白质的折叠及清除内质网中积累的未折叠蛋白,使细胞在内外环境不利的情况下仍能存活。如果严重情况下细胞产生UPR-ERstress仍不能克服内质网中不断积累的未折叠蛋白质,则内质网应激可诱导细胞凋亡。
人体内的蛋白质至少有1/3以上是糖蛋白,存在于各种组织和不同细胞中,具有非常重要的功能。由内质网合成并输送到高尔基体、溶酶体、细胞膜和细胞外的蛋白质多数是糖蛋白。糖蛋白根据糖链结构不同主要分成O-聚糖和N-聚糖两种。N一聚糖在细胞总体糖蛋白中的合成是一个共翻译(co-translation)过程,随着翻译的进行肽链延伸进入内质网腔,N.聚糖可被位于内质网腔膜结构上的加工酶修饰加工至高甘露糖型,再进入高尔基体,继续被加工合成。
糖蛋白N.糖链的生物合成是由粗面内质网上的一种十四寡糖在糖基转移酶的催化下转移到天冬酰胺上,形成N一连接寡糖。内质网中的Q.葡萄糖苷酶I和II切除该寡糖链的3分子葡萄糖,α-甘露糖苷酶再切除1分子甘露糖,形成高甘露糖型的N-糖链。高甘露糖型的N-糖链进入高尔基体被其中的α-甘露糖苷酶I水解掉3分子甘露糖后,继续被高尔基体中的其它酶修饰,形成杂合型及其复杂型N.糖链。糖蛋白N.糖链的合成是一个连续的酶促反应,其中任何酶的缺失或异常都将引起N一糖链合成异常,甚至导致其它细胞反应。
内质网以及高尔基体中的Q.甘露糖苷酶I是一个非常重要的N.糖链加工酶,它是控制高甘露糖型N.糖链向杂合型及复杂型N.糖链转化的关键酶。一旦其功能发生障碍,可能引起各种类型N.糖链,包括高甘露糖型、杂合型及复杂型糖链的合成异常。过去对甘露糖苷酶的研究主要集中在参与酵母蛋白和一些跨膜蛋白的降解中。而本文针对在人肝癌772l细胞特异性抑制α-甘露糖苷酶I,是否会引起内质网应激进行研究。DMJ(1-deoxymannojh-imycin),1.脱氧甘露糖吉利霉素是高尔基体中的α-甘露糖苷酶I的特异性抑制剂,本论文研究发现,DMJ可以使人肝癌7721细胞发生内质网应激,表现为伴侣蛋白GRP78、转录因子CHOP(C/EBPhomologusprotein)表达上调,转录因子XBPl剪接激活及caspase-12剪切激活。
N.乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferaseV,GnT-V)是另一种分布在高尔基体中的一种重要的N-糖链加工酶,它以UDP-GlcNAc为供体底物,催化C2C2七糖二天线阶段或C2C2,4八糖三天线阶段的N糖链分别形成C2C2,6及C2,4C2,6三天线及四天线N糖链。GnT-V与恶性细胞的N一糖链变化关系密切,在肿瘤的形成及发展过程中起着非常重要的作用。本实验采用GnT-V反义cDNA质粒转染SMMC7721细胞的方法,获得稳定表达株ASGnT-V7721。而且,内质网应激标志性分子GRP78和XBPl及PERK的变化也证明了ASGnT-V772l细胞存在内质网应激。