桃果实软化是成熟过程中一个复杂而有序且是不可逆的过程,涉及一系列的生理生化反应,进而导致果实的耐藏性和抗病性下降,缩短货架寿命。一般认为,果实软化与细胞壁中果胶类物质的溶解和降解有关,从而造成细胞彼此分离和胞壁总体结构上的破坏。普遍认为,果实软化与细胞壁果胶降解酶的活性密切相关,如多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、果胶裂解酶和β-半乳糖苷酶。克隆和表达分析与桃果实果胶类物质降解相关的酶类基因,有助于在分子水平上阐释这些酶在桃果实成熟软化中作用,找出关键因子,为果实软化调控、延长果实保鲜期提供依据。　　 本论文以‘雨花1号’桃果实为试验材料,通过同源克隆方法,获得了与果胶降解相关的酶类基因,并对其进行了生物信息学分析,建立了半定量和荧光定量PCR技术体系,研究了各基因在非果实器官或组织、果实生长发育及‘雨花1号’和‘京玉’采后成熟软化进程中的表达模式。主要研究结果如下:　　 1.桃不同器官或组织的总RNA和DNA同时提取　　 由于桃不同器官组织的发育程度不同,其含有多糖和多酚等次生代谢物质的种类和含量存在着显著差异,因而用一种方法从这些器官或组织中提取高质量扣产量的总RNA和DNA是相当困难的.经过多次试验,以‘雨花1号’桃为试验材料,研究出了一个能够获得大量并且具有高质量的RNA和DNA同时提取方法,该方法适用于不同发育和贮存期桃果实中总RNA和DNA的提取,也适用于花、叶、茎、根等器官.利用这种改进的提取方法,可以在1克鲜样中提取到28-750μg总 RNA,30.46-137.04μg基因组总 DNA；A260/A280比值前者介于1.90与2.15之间,后者为1.81-1.94；且A260/A230的比值都大于2.0,表明所提取的RNA和DNA样品较纯净,可用于基因克隆、基因组扩增等分子生物学试验研究。　　 2.桃果实果胶物质降解相关基因的克隆和序列分析　　 以‘雨花1号’桃果实室温贮藏2 d的cDNA样品为材料,通过同源比对设计简并引物,经RT-PCR获得桃果实果胶质降解相关基因的保守片段后,根据其序列信息,设计特异引物,利用RACE技术,成功克隆了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(PpARF2)(GenBank登录号EF568775)、果胶裂解酶(PpPEL1和PpPEL2)(GenBank登录号分别为GU462127和EF568780)及β-半乳糖苷酶(PpGAL1和PpGAL2)基因(GenBank登录号分别为EF568777和EF568776)的cDNA全长序列,和β-半乳糖苷酶另一基因(PpGAL3)的3’-RACE片段(GenBank登录号GU462128)。并利用生物信息学方法对其cDNA和推导的氨基酸序列进行了理化性质、功能域及与其它物种相应序列的比对和系统发育分析。　　 3.半定量和荧光定量PCR技术体系建立　　 建立并完善了用于桃果实果胶物质降解相关基因表达的半定量和荧光定量PCR技术体系,该体系具有良好的特异性、稳定性和重复性,通过溶质桃中已知表达模式的两个基因,内切多聚半乳糖醛酸酶基因和扩展蛋白基因,验证了该体系的正确性。　　 4.内参基因稳定性鉴定研究　　 由于内参基因在不同的试验环境条件下,其表达的稳定性存在着很大的差异,因此,选择稳定表达的内参基因是 RT-qPCR试验成功的前提。对参试的11个内参基因在‘雨花1号’和‘京玉’桃不同cDNA样品中表达的稳定性进行了比较分析,发现RPL13和PLA2基因在不同样品中表达水平差异较大,不适合做内参基因；而常用于荧光定量表达分析的内参基因18S rRNA、GAPDH和ACT的表达稳定性也比较差,也不适合做内参基因；只有TEF2、UBQ10和RPⅡ基因,才在所有的供试样品中表达稳定,可以用于总样品组合中桃果实果胶质降解相关基因的表达分析,其中,TEF2和RPⅡ基因还可以用于其它任一分组样品中荧光定量PCR数据的校正。　　 5.桃果胶裂解酶基因表达特性分析　　 以‘雨花1号’桃(溶质)采后分别用乙烯和1-MCP处理24 h,室温贮藏6d的果实为试验材料,及不经外源生长调节物质处理和‘京玉’桃(硬桃)采后果实为对照样品,同时还有‘雨花1号’桃的非果实器官或组织,采用半定量和荧光定量PCR对PpPELs的时空表达模式及其乙烯调控作用进行了分析研究。结果表明,桃PpPELs主要在成熟果实中积累,其中PpPEL1在其它非果实器官及生长发育期的果实中也有表达,只是转录本含量较低；而PpPEL2只在采后的果实中表达,且在整个贮藏期其转录本含量在两个品种中均高于PpPEL1。PpPELs在‘京玉’桃采后贮藏果实中表达水平的波动性明显小于‘雨花1号’,但采收当天PpPEL1和PpPEL2的转录本含量,‘京玉’多于‘雨花1号’。乙烯和1-MCP的处理对PpPELs的表达没有显著影响,可能不受乙烯诱导表达。　　 6.桃糖苷水解酶基因表达特性研究　　 以乙烯和1-MCP分别处理24 h后,并在室温下贮藏6 d的溶质桃‘雨花1号’果实为试验材料,和不经生长调节物质处理及‘京玉’桃,另一品种类型——硬桃,采后室温贮藏果实为对照样品,同时还有‘雨花1号’桃的非果实器官或组织,采用半定量和RT-qPCR对桃α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶基因的表达特性进行了分析研究。结果表明,桃PpARF2、PpGAL1和PpGAL2主要在成熟器官或组织中积累,而PpGAL3主要在其它非果实器官及生长发育期的果实中表达,且在整个贮藏期内前三者在‘雨花1号’桃果实中的表达量明显高于‘京玉’。外源乙烯处理促进了PpGAL2基因的表达,抑制了PpARF2和PpGAL3基因转录本的积累,却对PpGAL1的作用较小；此外,PpARF2还表现出对乙烯浓度的敏感性,即中浓度促进其表达,而低或高浓度乙烯会抑制其表达。　　 7.以溶质桃‘雨花1号’和硬肉桃‘京玉’为试验材料,对桃果胶质降解相关基因表达数据进行了聚类和主成分分析研究。聚类分析结果表明,除PpGAL3外,其它在‘雨花1号’桃果实中的表达量要明显高于‘京玉’,说明这些基因在桃果实采后成熟软化中起到了不同程度的促进作用。主成分分析表明,在供试的8个基因中,主要在成熟软化早期阶段表达的基因依次是PpARF2、PpPEL2、PpPEL1和PpendoPG；基于成熟软化早期高表达的基因对果实质地的降低作用强于后期,可知PpARF2是果胶降解相关基因中对果实成熟软化作用最强。