水稻重要真菌病害包括稻瘟病(Rice Blast).稻曲病(RIce False Smut)、纹枯病(RIce Sheath Blight)等,每年对水稻的产量和质量造成了很大的影响,给经济带来严重的损失。其中,水稻稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的相关研究如侵染过程、致病基因、抗病基因等取得很大的进展。然而,水稻稻曲病和纹枯病的研究却相对滞后。水稻稻曲病是一种世界性水稻真菌病害,是由稻曲菌引起的水稻穗部病害,并形成稻曲球,生产上对稻曲病的防控单一,病原菌耐药性逐年增加。迄今,对稻曲菌的研究较少,仅限田间调查、侵染过程、生物学特性等方面,其致病相关的细胞学与分子机制研究严重滞后。因此,基于以上研究背景,论文的第一部分主要展开了对水稻稻曲菌分离鉴定与分子相关研究,研究内容主要包括水稻稻曲菌(villosiclava virens)的形态学、生物学及基因组研究：同时第二部分对水稻纹枯病菌(Rhizcotonia solani)侵染过程和染色体核型细胞学进行研究。为深入认识水稻重要真菌病害侵染细胞学与致病机制,及病原菌与寄主的互作机制打下基础。本研究主要取得以下结果：1、水稻稻曲病菌的分离。从四川、云南、福建、浙江、安徽等地采集了291个稻曲球样本,利用厚垣孢子悬浮液分离方法获得206株稻曲菌,该技术分离成功率为70.5%；从四川4个地方采集了26个菌核样本,成功分离了26个菌株,菌核分离成功率为100%。2、水稻稻曲病菌形态学观察。本文应用光学显微镜对厚垣孢子和分生孢子的萌发方式进行了观察：厚垣孢子的萌发方式有两种：一种是孢子一端长出菌丝,在菌丝的顶端产生薄壁分生孢子；另外一种孢子两端萌发长出菌丝,在菌丝的顶端长出分生孢子,这两种方式是厚垣孢子常见的萌发方式。在扫描电镜下,厚垣孢子表面可观察到疣状突起,疣状突起呈尖状或不规则弧形,大约长度为250-550 nm,而人工培养基上产生的厚垣孢子表面的疣状突起比较平滑。菌核的形态多样,呈现黑色的不规则椭圆、扁平或马蹄形等,大小约2-20mm。菌核的内部由菌丝紧密纠结而成。3、水稻稻曲菌生物学特性的研究。本文主要研究了不同培养基,碳氮源,温度,pH值,水势,光照条件对稻曲菌菌丝生长的影响；温度和培养时间对分生孢子萌发的影响；以及分生孢子的致死温度。稻曲菌菌丝在XBZ、PSA、PDA3种培养基上生长良好,形成白色馒头状菌落：而在CA上生长受到抑制。稻曲菌菌丝的最适生长C源为蔗糖和淀粉,生长速率分别是2.6mm和2.4mm d-1：最适生长N源为无机铵态氮,尿素可抑制稻曲菌菌丝的生长。该菌菌丝能够在12-32℃范围内生长,最适生长温度为28-30℃,在28℃时生长速率为2.5mm d-1,在30℃时生长速率为2.4 mm d-1,34℃为菌丝的致死温度。稻曲菌菌丝适应的pH范围比较广,最适pH值是7-8。菌丝在水势为0 Mpa时生长速率最快；随着水势的降低,菌丝生长速率减慢,当水势达到-8 Mpa培养21d时,菌丝基本不生长。稻曲菌在黑暗条件下菌丝生长速率显著高于全光照和12h光暗交替；在全光照下,菌丝生长受到抑制。分生孢子萌发的温度范围为12℃到34℃,最适萌发温度是28-30℃；分生孢子在最适温度的最短萌发时间为2h。稻曲菌分生孢子的致死温度为50℃。这些结果为系统了解稻曲菌的生物学和生态学、以及侵染水稻环境条件提供了详细背景条件。4、水稻稻曲菌核型分析。用DAPI染色分生孢子和菌丝进行细胞核观察,发现菌丝顶端的每个分生孢子为单核,而分生孢子萌发生长的菌丝为多核的细胞。采用脉冲电泳技术(PFGE)分离稻曲菌染色体DNA,结果显示稻曲菌至少有10条染色体,染色体的分子量范围为6Kb-6Mb,估计基因组分子量至少为23.6Mb。本试验结果为进一步研究稻曲菌的基因重组、基因改造和导入新基因等在染色体上定位方面奠定了基础。5、水稻稻曲菌GFP的转化。采用根癌农杆菌技术(ATMT)转化双元载体pCAMBIA1300GFP(包含gpd和sGFP基因)到稻曲菌分生孢子中。实验确定了稻曲菌转化子对潮霉素筛选浓度为200μg/ml。对阳性转化子进行PCR扩增,结果得到两个目的条带的PCR产物,通过测序和对比基因序列发现条带分别为潮霉素B和GFP基因,条带大小分别为600bp和720bp。因此,采用ATMT技术能成功构建稻曲菌的突变体库,为筛选功能基因奠定基础。6、稻曲菌交配型鉴定。根据麦角菌属(Clavicipitaceae)中alpha结构域和HMG-box相应的核苷酸保守区域设计MAT1基因的简并引物。采用Multiplex PCR技术,分别从分生孢子分离菌株和子囊孢子分离菌株中扩增到MAT1-1-1和MAT1-2-1基因,DNA片段大小分别为250bp和220bp。结果证明了稻曲菌为同宗配合的真菌,不需要其它型菌株就能产生有性子囊孢子,完成有性生殖。这一结果为将来的遗传分析、致病基因等研究奠定了分子基础。7、水稻稻曲菌基因组初步分析。我们构建了稻曲菌基因组180bp的DNA小文库,应用velvet (V1.2.03)软件进行组装分析,结果显示：稻曲菌基因组180bp文库的contig总数为21970个,Scaffold的总数为17904；总碱基数为3.6G,碱基的正确识别率为95.39%；总的碱基的GC含量为51.498%。虽然本实验仅仅构建了稻曲菌的基因组小文库,但这对基因组质量的评估和预测病原菌致病基因提供了有效途径。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG1融合群是水稻纹枯病的致病菌,严重时引起水稻整株枯死。AG1寄主范围广泛,能侵染包括水稻、小麦、玉米、大豆、甘蓝等多种粮食作物以及蔬菜果树。在融合群AG1的几个亚群中,IA已做了大量的研究,而IC的研究相对较少,因此,本部分主要对IC做了两个方面的研究,结果如下：1、立枯丝核菌AG1 IC对大豆、甘蓝侵染过程的观察。接种8-12h后,AG1 IC菌丝开始在大豆和甘蓝叶片上生长,菌丝在甘蓝叶片上生长速率快于大豆(接种28h)。接种30-48h后,菌丝已覆盖整个甘蓝叶片并且病害症状的严重度高于大豆。接种96h后,甘蓝整片叶片出现棕褐色和水浸状的病斑,而大豆叶片仅出现椭圆型或不规则的棕色病斑。AG1 IC侵染甘蓝和大豆叶片时,形成侵染垫和附着孢,并在附着孢的前端形成侵入钉,这些侵入结构通过气孔侵入寄主植物或者直接通过表皮侵入寄主植物。2、立枯丝核菌AG1 IC的核型分析。采用DAPI核酸染料对AG1 IC菌丝细胞核进行染色,荧光显微镜观察细胞核数量范围为1-17个,而大多数细胞的核数为4和6。本实验采用碱性品红染色和菌丝压片法,显微观察菌丝染色体形状和数目；AG1 IC的染色体小,呈线形,细胞核的染色体数量范围为10-18条,但大多数核的染色体数为12和13条。AG1 IC染色体的成功分离将有利于分子遗传、构建遗传图谱和致病基因在染色体上定位的研究。