研究背景骨肉瘤是一种起源于成骨性间叶组织的最常见的原发性恶性肿瘤,好发于儿童和青少年,约占所有骨肿瘤的20%。目前由于早期诊断和化疗手段迅速的发展使得患者肺转移率得到明显控制,5年生存率提高了50%以上,但约有30%患者化疗效果不佳,仍有半数以上的患者死于骨肉瘤的转移和复发,骨肉瘤的治疗处于一个平台期。近年来尤其是进入二十一世纪以来,由于分子生物学领域理论和技术水平的不断提高,使得医学科技工作者对骨肉瘤的发生机制等基础研究方面的认识在分子水平达到了前所未有的程度,期待在骨肉瘤发病机制及基因治疗研究方面有突破性的进展。各种生物体的生理、生化及行为过程都表现出一定的昼夜节律变化。昼夜节律生物钟可看作是机体内的定时系统,因其存在使机体内多种生理活动、行为模式得以表现出近似24h的规律性节奏,从而对其所生存的具有周期性的环境做出适应性反应。生物节律是生命活动的基本特征之一,不仅整个机体之中,而且器官、组织、包括游离的单个细胞之中也广泛存在。机体内维持这些节律的基本结构即是生物钟(circadian clock),而产生和维持生物节律运转的分子生物学基础即是生物钟基因(circadian clock genes)。至目前为止,在哺乳动物体内至少已发现10多种生物钟基因。昼夜节律发生的物质基础被称作生物振荡器(oscillator),它是由一系列呈节律表达的生物钟基因及其相应蛋白产物作为特异的核心元件所构成,而由这些特异的核心元件构成的转录-翻译反馈环路生物节律的即是其基本分子机制。生物钟基因是生命活动的时序控制器,从机体微观方面影响、控制着机体的生长、发育及疾病、衰亡等,通过调控细胞增殖周期、细胞凋亡、神经内分泌和免疫功能等方面与还与恶性肿瘤的发生、发展、治疗和预后等关系密切,国内外大量报道证实肿瘤的发生与生物节律紊乱密切相关。生物钟基因Period家族中的Per2基因是重要的生物钟基因之一,在机体中枢系统、外周组织以及肿瘤细胞中都有存在,除了本身的生物周期节律调节功能,还具有非节律功能即在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。现已发现在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤中均可检测出Per2的异常表达,但在人骨肉瘤中的作用尚未见报道,因此进一步研究Per2将为明确骨肉瘤的发病机制,将有助于探索一条针对骨肿瘤的诊断与治疗、判断预后及转归等的新方法。目的构建并鉴定pEGFP-N1-hPer2真核表达载体,观察其在骨肉瘤细胞MG63中的表达,并通过细胞水平的体外实验探讨hPer2对人骨肉瘤细胞MG63作用及其机制。方法 (1)应用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增hPer2,并将PCR产物经双酶切后定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,hPer2重组质粒经双酶切及测序鉴定,从而成功构建pEGFP-N1-hPer2真核表达载体。(2)采用脂质体介导转染骨肉瘤细胞MG63,qRT-PCR和Western blot分别检测hPer2的表达情况。(3)利用脂质体法将hPer2真核表达质粒pEGFP-N1-hPer2和空质粒pEGFP-N1分别转染入MG63,分为pEGFP-N1-hPer2转染组、pEGFP-N1空质粒转染组和不做任何处理的空白组3组。应用RT-PCR、Western blot检测Per2基因和蛋白的表达,CCK-8法、流式细胞仪和Transwell小室法分别检测细胞增殖、凋亡、周期分布和侵袭能力的变化。结果 (1)重组质粒pEGFP-N1-hPer2经PstⅠ、KpnⅠ双酶切和测序与hPer2基因序列一致。(2)利用脂质体介导将pEGFP-N1-hPer2重组质粒成功转染到骨肉瘤细胞MG63中并获得了hPer2基因的过表达。(3)与对照组和空白组比较,实验组通过hPer2过表达使肿瘤细胞增殖能力下降、凋亡率增加及穿膜细胞数减少。结论成功构建pEGFP-N1-hPer2真核表达载体,并能够在骨肉瘤细胞MG63中过表达。hPer2在人骨肉瘤细胞系MG63中过表达对其具有生长抑制作用,因此利用生物钟基因hPer2可以作为人骨肉瘤基因治疗的可能方法之一。