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迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的人畜共患病原菌,导致鱼类的出血性败血症和人类的胃肠炎及肠外感染。目前已鉴定了E. tarda的一些毒力因子,包括生物被膜、溶血素、Ⅲ型分泌系统(T3SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)等。然而,对这些毒力因子或其他致病相关因子调控网络的了解甚少。随着E. tarda EIB202全基因组序列的公布,系统性地研究E. tarda的毒力和环境适应性相关元件和调控网络成为可能。双组分系统(Two-component system, TCS)是细菌最关键的信号转导系统,与病原菌在宿主体内外不同环境条件下的适应能力密切相关。TCS由组氨酸激酶(Histidine kinase,HK)和响应调节蛋白(Response regulator, RR)两个元件组成,分别负责信号的接收和传递。生物信息学分析表明E. tarda EIB202编码63个假定的TCS蛋白,包括30种HK蛋白和33种RR蛋白。本文成功构建了33种RR蛋白的基因缺失突变株,考察了这些突变株对E. tarda菌体生长、生物被膜生成、耐药性、压力应激、T3SS和T6SS蛋白的表达和分泌以及体内毒力的影响,发现4种RR蛋白与生长相关,4种RR蛋白与生物被膜生成相关,2种RR蛋白与耐药性相关,4种RR蛋白与压力应激相关。体内实验发现EsrB和PhoP与E. tarda的致病能力密切相关。EsrB是T3SS和T6SS蛋白表达所必需的,而PhoP则通过EsrB部分调控T3SS和T6SS的表达,并介导E. tarda抵抗阳离子抗菌肽(CAMP)的杀伤。在生物体内,尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶(Ugd)负责将尿苷二磷酸-葡萄糖转化为带正电荷的尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸,使细胞壁发挥CAMP抗性。为了进一步了解E. tarda中CAMP抗性的调控机制及对毒力的影响,本文考察了Ugd的功能和TCS对Ugd的调控作用。转录分析发现PhoP介导CAMP对Ugd的诱导表达。本文发现E. tarda Ugd蛋白影响细胞表面结构。Augd突变株合成不完整的脂多糖结构,包含截断的类脂A-核心多糖,无O-抗原附着。Augd突变株的生物聚集能力和生物被膜形成能力增强,溶血能力减弱。Augd突变株对CAMP很敏感,可能主要由其改变的脂多糖结构导致。通过采用不同的感染模型,本文发现Augd突变株在巨噬细胞内的存活能力减弱,在斑马鱼成鱼中毒力显著下降,在大菱鲆和斑马鱼幼鱼中定殖能力显著下降。此外,腹腔注射Augd菌体能够在大菱鲆体内激起显著的保护性免疫反应,当免疫剂量为107CFU/g体重时相对免疫保护率达到76.7%。鉴于PhoQ/PhoPTCS对E. tarda压力应激和毒力的重要作用,本研究通过比较野生株和ΔphoP突变株的蛋白质组鉴定了E. tarda中受PhoP调控的蛋白(Regulon)。在全菌蛋白质图谱中,鉴定到18种蛋白的表达量具有2倍及2倍以上差异。其中,13种蛋白的表达完全依赖PhoP,另外5种蛋白在ΔphoP突变株中表达量上调。这18种蛋白参与不同的生理生化功能,包括能量产生、氨基酸代谢和抵抗氧化应激等。采用实时定量PCR方法分析了差异表达蛋白的mRNA水平,证实了蛋白质组结果的可靠性。有趣的是,F1F0ATP合成酶p-亚基(AtpD)的表达受到PhoP的严格调控,且影响E. tarda的生长和毒力。E. tarda EIB202的F1F0ATP合成酶由atpIBEFHAGDC基因簇编码,且9个基因共转录。实时定量PCR分析表明PhoP正调控9个ATP合成酶基因的表达。凝胶迁移实验表明PhoP通过直接结合atpl启动子,调控ATP合成酶操纵子的表达。本研究丰富了人们对受PhoP调控的蛋白种类的理解,揭示了PhoP调控ATP合成酶表达的新功能。