多基因策略被证明能有效地延缓害虫对转基因植物产生抗性，该策略是指将能够识别不同结合位点的蛋白共同用于转基因植物中。2014年全球转Bt基因玉米的种植面积达到5.5千万公顷，占据全球玉米种植总面积的30%，其中对玉米螟有效的基因主要是cry1Ab、cry1Fa。如此大面积种植含有这些基因的转基因玉米，也大大提高了玉米螟对这些基因产生抗性的可能性。因此鉴定和发掘与Cry1A、Cry1Fa蛋白无交互抗性的新型cry基因，进而研究解释其杀虫机制，对于研发新一代转基因抗虫玉米具有重要的理论意义和应用价值。cry1Ie基因是本实验室分离克隆的、具有自主知识产权的杀虫基因，由于其编码的Cry1Ie蛋白对玉米螟具有高的杀虫活性，且Cry1I蛋白与目前商业化应用的Cry1A类蛋白无交互抗性，目前已经被用于转基因玉米的研究中。本研究旨在探索不同Cry1I蛋白的杀虫活性及Cry1I蛋白的作用机制，为Cry1Ie基因的推广及应用提供理论依据和候选基因。本研究将新型的Cry1Ie2蛋白用胰蛋白酶进行消化，获得55kDa的核心片段。并通过亲和层析和离子交换对Cry1Ie2蛋白进行纯化，最终获得纯度较高的蛋白。纯化后的Cry1Ie2原毒素对7种鳞翅目害虫和1种鞘翅目害虫的杀虫活性测定结果显示：Cry1Ie2对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis，Guenée）和欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis，Hubner）具有高的活性，LC50分别为0.51μg/mL和18.49μg/mL。而甜菜夜蛾（Spodoptera exigua，Hiibner），美洲棉铃虫（Helicoverpazea，Boddie）和黄粉虫（Tenebrio molitor，Linnaeus）的生物活性测试中均未发现明显的杀虫活性。秋粘虫（Spodoptera frugiperda，J.E.Smmith）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens，Fabricius）和亚洲棉铃虫的生物活性测试中，虽致死率与阴性对照相同，但是有明显的体重抑制。同位素125I标记的Cry1Ab蛋白和生物素标记的Cry1Ie2蛋白被用于竞争结合试验。125I-Cry1Ab蛋白在欧洲玉米螟的刷状缘膜微囊泡（Brush BorderMembrane Vesicles，简称BBMVs）竞争结合试验中，即使在最高的的测定浓度（未标记的Cry1Ie2蛋白）下，未标记的Cry1Ie2蛋白也无法竞争125I-Cry1Ab蛋白与欧洲玉米螟BBMV的结合位点，证明Cry1Ie2蛋白不能识别Cry1Ab蛋白在欧洲玉米螟BBMV中的结合位点。Bio-Cry1Ie2在欧洲玉米螟BBMV上的竞争结合试验进一步证明，Cry1Ab或者Cry1Fa蛋白不能竞争Bio-Cry1Ie2蛋白与欧洲玉米螟BBMV的结合位点。因此，推测Cry1Ie2蛋白与Cry1Ab、Cry1Fa在欧洲玉米螟体内无交互抗性。这些数据支持cry1Ie2可以作为候选基因与cry1Ab或者cry1F一起用于转基因抗虫玉米，从而更好的防治欧洲玉米螟和亚洲玉米螟害虫，同时降低害虫产生抗性的几率。溶解后的欧洲玉米螟BBMV蛋白混合物经分子筛层析分离到不同的收集管中，分布于Peak1、Peak2、Peak3、Peak4、Peak5、Peak6中。通过斑点杂交分析Bio-Cry1Ie1蛋白及Bio-Cry1Ab蛋白与分子筛纯化后BBMV蛋白的结合情况，结果显示Bio-Cry1Ie1蛋白和Bio-Cry1Ab蛋白均可以与收集管C8、C9、C10中的BBMV蛋白结合，而收集管C6、C7、C11中的BBMV蛋白只能与Bio-Cry1Ie1结合。由此我们推测在收集管C6、C7、C11中可能包含某种特殊的受体蛋白仅能够被Bio-Cry1Ie1蛋白识别，不能被Bio-Cry1Ab识别，这可能是Cry1Ie1与Cry1Ab蛋白在欧洲玉米螟体内无交互抗性的重要原因。因此对收集管C6、C7、C8、C9、C10、C11中的蛋白进行纯化。纯化的样品进行蛋白质二级质谱分析（LC-MS/MS）。质谱鉴定结果与鳞翅目数据库的比对，共获得14个大小不同的肽段，肽段大小从22kDa到213kDa不等。其中能同时与Cry1Ab和Cry1Ie1结合的蛋白有4种，能同时与Cry1Ab、Cry1Ie1和对照结合的蛋白有2种；仅能与Cry1Ie1结合，不能与Cry1Ab结合的蛋白有6种；仅能与Cry1Ab结合，不能与Cry1Ie结合的蛋白有2种。105kDa的V-ATP酶和69kDa的APN3b仅能与Cry1Ie1蛋白结合，不能与Cry1Ab蛋白结合；但这些肽段是否是Cry1Ie的特异性受体蛋白，还需要深入研究。本研究将10个cry1Ia基因在Rosetta（DE3）表达菌株中成功表达，其中cry1Ia20、cry1Ia21、cry1Ia23、cry1Ia25、cry1Ia26、cry1Ia27、cry1Ia28、cry1Ia29能正常的表达81kDa的典型的Cry1I蛋白，同时我们还发现另外一条60kDa的蛋白条带存在，且表达量与81kDa蛋白的表达量相近。而cry1Ia22和cry1Ia24的蛋白表达产物中，仅检测到60kDa的蛋白条带。将60kDa的蛋白条带进行蛋白质一级质谱分析，结果显示该片段属于Cry1Ia蛋白。由此推测60kDa蛋白可能是由81kDa的Cry1Ia蛋白降解产生。生物活性测试结果显示，不同Cry1Ia蛋白仅有一个氨基酸的差别，但是活性差异很大。Cry1Ia蛋白氨基酸序列和生物活性对比分析发现，141位的丝氨酸和377位的丝氨酸对Cry1Ia蛋白的小菜蛾和亚洲玉米螟生物活性至关重要，80位的甘氨酸对Cry1Ia蛋白的亚洲玉米螟生物活性至关重要，对小菜蛾的生物活性并不重要。进化分析显示这10个Cry1Ia基因分化为2个分支，Cry1Ia20、Cry1Ia21、Cry1Ia22Cry1Ia26、Cry1Ia27、Cry1Ia28、Cry1Ia29分为一支，Cry1Ia23、Cry1Ia24、Cry1Ia25分为另外一支，329、376和547位的氨基酸是决定这10个Cry1Ia蛋白分化为2支的主要因素。