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糖尿病、肥胖、代谢综合症等一系列营养相关慢性疾病的发病人数逐年增多,已成为世界各国密切关注的主要公共卫生问题。研究表明,胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是代谢综合症和2型糖尿病等疾病发病机制中的关键环节。胰岛素抵抗与膳食平衡密切相关,因此寻求胰岛素抵抗在营养学上的防治策略具有重要而深远的意义。 研究发现,亮氨酸做为支链氨基酸,不仅仅是必需氨基酸,而且是一种重要的营养信号分子。参与胰岛素信号传导、骨骼肌的能量调节以及肌肉蛋白的合成等重要生物学过程。亮氨酸与胰岛素抵抗的关系引起了研究者的广泛关注。但是,由于研究对象的差异(生理或病理状态)、给予亮氨酸的方式(急性、慢性)、剂量以及作用时间不同,亮氨酸对胰岛素抵抗的影响结论并不一致。本研究给正常大鼠和高脂膳食诱导的胰岛素抵抗大鼠给予不同剂量的亮氨酸干预6个月,观察膳食补充亮氨酸对正常大鼠和胰岛素抵抗大鼠机体代谢,胰岛素敏感性,机体氧化应激水平的影响,以及mTOR磷酸化水平的改变,以阐明不同剂量亮氨酸干预对正常大鼠及胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响并从 mTOR途径对其分子机制进行初步探讨。为亮氨酸膳食干预胰岛素抵抗及其相关慢性病研究提供新的科学依据和理论思路。对于寻求新的饮食防治策略和积极有效的分子靶点,有极大的理论价值和现实意义。 目的:通过观察不同剂量亮氨酸补充对正常大鼠和高脂喂养大鼠机体代谢,胰岛素敏感性,机体氧化应激水平以及mTOR表达及其磷酸化水平的改变,探讨亮氨酸对正常大鼠及胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响及其相关机制。 方法:通过高脂膳食喂养建立胰岛素抵抗大鼠模型,正常饲料喂养大鼠和高脂饲料(脂肪供能比达到53.8％)喂养大鼠分别饲以添加了0,1.5％,3.0％和4.5％亮氨酸饲料进行膳食干预。实验结束前一周,进行葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验。25周后处死,测定血脂、血糖、血胰岛素,计算HOMA指数。高效液相色谱法检测大鼠血清亮氨酸水平。ELISA法检测血中相关激素和脂肪细胞因子:胰高血糖素、瘦素、脂联素。酶法测定肝脏和骨骼肌TG水平以及GSH/GSSG。Real time-PCR法检测组织(肝脏、骨骼肌)中SOD mRNA。Western blotting检测肝脏mTOR及磷酸化mTOR表达水平。 结果: 1.动物的代谢改变: (1)高脂饲料喂养大鼠的进食量明显低于基础饲料喂养组(P<0.05)。亮氨酸有降低正常大鼠进食量的趋势,而对高脂大鼠,亮氨酸有增加其进食量的趋势。 (2)能量摄入结果表明,高脂组大鼠仅在实验前两周的能量摄入明显高于正常组大鼠。亮氨酸补充对大鼠能量摄入无明显影响。 (3)大鼠体重变化趋势表明,从第6周开始,HFD组和HFD+1.5％leu组的体重开始升高;第7周时,HFD组大鼠体重已显著高于ND组(P<0.05);11周以后,HFD+1.5％leu、HFD+3.0％leu、HFD+4.5％leu组大鼠体重显著高于HFD组大鼠(P<0.05)。表明亮氨酸补充可显著增加高脂大鼠体重,对正常大鼠无明显影响。 (4)HFD组肾周脂肪占体重的比值显著性升高(P<0.05)。1.5％和3.0％亮氨酸补充进一步增加高脂大鼠肾周脂肪占体重的比值。表明亮氨酸可促进高脂大鼠脂肪组织的脂肪聚集。 (5)HFD组的总胆固醇水平明显高于ND组,除了HFD+1.5％leu组甘油三酯水平明显高于HFD组外,亮氨酸对正常大鼠和高脂大鼠血脂水平无明显影响。大鼠血清中的胰高血糖素、瘦素、脂联素各组也没有显著性差异。 2.胰岛素敏感性的改变: (1)各组大鼠的空腹血糖水平无显著性差异。HFD组血胰岛素水平显著高于ND组(P<0.05)。各高脂饲料亮氨酸干预组的血胰岛素水平均明显低于HFD组(P<0.05)。HFD组的HOMA-IR指数均显著高于正常对照组(P<0.05)。HFD加亮氨酸干预组的HOMA-IR指数均明显低于HFD组, (2)胰岛素耐量试验血糖曲线下面积(areas under the curves)结果表明, HFD组胰岛素耐量实验曲线下面积(AUC)明显高于ND组(P<0.05)。HFD加亮氨酸干预组的曲线下面积均比HFD组低,有显著性差异,P<0.05。葡萄糖耐量试验结果表明,各HFD加亮氨酸干预组与HFD组之间血糖值以各组血糖曲线下面积(AUC)均无显著性差异(P>0.05)。 3.氧化应激水平的改变 (1)大鼠肝脏和骨骼肌GSH/GSSG比值结果表明,仅ND+1.5％leu组的GSH/GSSG明显高于ND组,亮氨酸补充对肝脏GSH/GSSG比值无明显影响。 (2)高脂大鼠肝脏和骨骼肌的TG含量显著增加(P<0.05),但是亮氨酸补充对正常大鼠和高脂大鼠的肝脏和骨骼肌的TG含量无明显影响。 (3)HFD组肝脏MnSOD mRNA的表达水平明显较ND组升高(P<0.01), HFD+1.5％组MnSOD mRNA的表达水平明显降低(P<0.05),表明亮氨酸补充可减轻肝脏的氧化应激。各组大鼠肌肉中MnSOD mRNA的表达水平无明显变化。 4.肝脏mTOR及磷酸化mTOR蛋白表达水平 经胰岛素刺激,亮氨酸可显著增强HFD大鼠pSer2448 mTOR的表达,差异有统计学意义。 结论: 1.膳食补充亮氨酸可显著增加高脂喂养胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性,对正常大鼠胰岛素敏感性无明显影响。 2.亮氨酸改善可能通过改善肝脏的氧化应激以及调控胰岛素信号通路,如激活mTOR途径改善胰岛素抵抗。 3.亮氨酸干预改善胰岛素抵抗的作用不是通过降低进食量及体重,也不是通过改善机体脂质的异位沉积来实现的。