研究背景与目的随着对新发现的CD4+T细胞亚群Treg研究的不断深入,转录因子Foxp3对Treg细胞的分化及行使功能至关重要的作用也得到了证实。Treg在疾病中发挥调控作用取决于其关键效应细胞因子的表达,而Foxp3又是这些关键效应因子的转录因子,因此,研究Foxp3在Treg细胞中对关键效应分子的表达意义重大。研究表明,转录因子多与其他重要蛋白伙伴结合,以复合体的形式来行使功能。因此,在复合体层次研究转录因子更能真实反映机体内情况。本研究以串联亲和纯化方法,从Tags knock-in小鼠的Treg细胞中分离并鉴定Foxp3的相互作用蛋白。本研究是开拓性研究,将填补国内外相关领域研究的空白,并为Foxp3相互作用蛋白功能的后续研究提供基础。实验方法1.转基因小鼠建立我们将德国法兰克福大学EUROSCARF机构提供的质粒p CeMM-CTAP(SG)提供给美国转基因小鼠制备专业公司(ingenious Targeting laboratory,Inc.,http://client.genetargeting.com),定制Tags-IRES-GFP转基因(knock-in,KI)小鼠。质粒pCeMM-CTAP(SG)含有串联Tags-IRES-GFP融合序列。其中串联Tags包括Myc、SBP和Protein G结合结构域,SBP和Protein G结合结构域之间含TEV酶切位点。Tags-IRES-GFP融合序列通过同源重组技术插入到Foxp3基因组序列的最后一个外显子(第14外显子)终止密码TAG之前。由于小鼠Treg细胞中表达的Foxp3蛋白C-端融合有多个Tag,因此可以直接用亲和纯化技术分离制备Foxp3相互作用蛋白。2.转基因小鼠的鉴定2.1鉴定GFP基因正确插入基因组:按照PCR引物设计基本原则,利用premier 5.0引物设计软件对GFP基因的PCR引物进行设计,设计的PCR引物序列为5’-TGAAGGATGCCCAGAAGGTA-3’(sense)和5’-CTGCTTGTCGGCCATGATAT-3’(anti-sense)。该引物位于GFP基因内部,PCR扩增后目的条带理论值为635bp。设计的PCR引物由上海Invitrogen公司合成。提取ki小鼠脾脏组织dna,利用该引物,pcr仪扩增、鉴定ki小鼠gfp正确插入小鼠基因组。2.2pcr鉴定ki小鼠基因组neo基因通过cre酶被敲除:pcr引物为5’-ggcgataccgtaaagcac-3’(sense)和5’-ctatgactgggcacaacaga-3’(anti-sense)。该对引物位于neo基因内部,目的条带大小预期值为679bp。2.3pcr鉴定ki小鼠foxp3纯合子:pcr引物为5’-gtgctttgtgcgagtggaga-3’(sense)和5’-gctgtgtctgacttgtattttgggc-3’(anti-sense)。该引物位于gfp基因两侧,理论预期值为2697bp。野生鼠及杂合子小鼠能出现724bp的无ki基因片段,而纯合子小鼠既不出现此条带,也不出现2697bp条带(pcr无法扩增此长度条带)。2.4foxp3基因mrna表达鉴定:提取ki小鼠新鲜脾组织总rna,逆转录后通过实时定量rt-pcr(qrt-pcr)检测foxp3的mrna是否表达及其与野生小鼠的差别。2.5foxp3融合标签的蛋白表达鉴定:提取ki小鼠脾组织蛋白,通过westernblot法对其是否正确表达进行鉴定。抗体分别为anti-foxp3抗体(abcam,ab54501)、anti-sbptag抗体(santa,sc-101595)、cd3抗体和anti-myc抗体(abbkin,a02060),分别检测foxp3蛋白及其融合标签sbp、proteing、myc是否正确表达,并比较foxp3蛋白表达量与野生鼠是否有差异。3.流式细胞术分选treg细胞提取转基因小鼠和野生型小鼠淋巴细胞,按比例加入apc-anti-cd4和pe-anti-cd25流式抗体,避光染色;pbs洗涤后,使用美国bdfacsariatmiispecialordersystem流式仪分选ki小鼠cd4+cd25+gfp+treg细胞和wtc57bl/6小鼠cd4+cd25+t细胞,收集细胞,离心弃上清后冻存至-80℃备用。4.亲和磁珠法分离纯化foxp3蛋白复合物ki小鼠cd4+cd25+gfp+treg细胞和wtc57bl/6小鼠cd4+cd25+t细胞裂解物超速离心去沉淀,上清用预洗涤过的igg磁珠和链霉亲和素磁珠(美国invitrogen公司)结合,4℃旋转孵育过夜。pbs洗掉非特异结合的蛋白后,磁珠上结合的目的蛋白用sds-page进行分离,westernblot鉴定目的蛋白及其复合物组分;或送质谱测序。5.质谱分析结合有靶蛋白的磁珠用pbs洗涤后弃上清,置于冰上送本校生物测试中心,用ltqorbitrapvelospro(thermofisherscientific)进行质谱检测。所得肽段和蛋白数据用配套的proteomediscoverer1.4软件分析。6.免疫共沉淀鉴定在1×lysisbuffer(50mmtris-hcl,ph7.5,1%np-40,1.5mm氯化镁,25%甘油,125mm氯化钠,25mm氟化钠,1mm钒酸钠,用之前加入1mmdtt,1mmedta,蛋白酶抑制剂)中分别裂解ki小鼠和wtc57bl/6小鼠treg细胞,高速离心弃沉淀;上清用包被有目的蛋白抗体的proteing磁珠4°c旋转结合过夜,pbs洗掉非特异结合的蛋白部分,最终的产物通过westernblot法,用潜在相互作用蛋白抗体进行检测,鉴定foxp3潜在伙伴蛋白。实验结果第一部分tags-ires-gfp转基因小鼠建立与鉴定tags-ires-gfp转基因子代小鼠脾脏和淋巴结组织中提取基因组dna,用pcr方法鉴定了ki小鼠基因组中gfp基因及相关tags片段均成功插入。ki小鼠与cre+小鼠交配后产生的f1代仔鼠中,用neo基因引物进行pcr检测,结果显示仔鼠基因组中neo基因被成功敲除。neo基因被成功cre掉的小鼠的子代基因组dna,用针对插入片段tags-ires-gfp两侧序列的引物进行pcr扩增,鉴定出tags-ires-gfp转基因纯合子小鼠。为了检测foxp3基因在wtc57bl/6和tags-ires-gfp转基因纯合子小鼠中表达是否有差异,我们对这两种小鼠中foxp3mrna进行rt-pcr分析。结果发现,foxp3mrna水平在两种小鼠中无明显差异,提示tags-ires-gfp外源基因的插入没有影响小鼠foxp3基因的表达。第二部分facs分离treg细胞我们用淋巴细胞分离液分离tags-ires-gfp转基因纯合子小鼠脾脏和肠系膜淋巴结淋巴细胞,再用facs法分选并收集cd4+cd25+gfp+treg细胞。结果显示,从ki小鼠中分选的cd4+cd25+gfp+treg细胞回测后纯度可达96.8%以上。对照细胞为facs分选的野生型(wtc57bl/6)小鼠cd4+cd25+t细胞,回测后纯度可达99.3%。第三部分转基因小鼠treg细胞中foxp3及tags表达鉴定我们进一步对tags-ires-gfp转基因小鼠treg细胞中foxp3蛋白及其tags标签是否正确表达进行鉴定,为进一步分离foxp3蛋白复合体提供依据。裂解tags-ires-gfp转基因小鼠cd4+cd25+gfp+treg细胞和wtc57bl/6小鼠cd4+cd25+t细胞提取总蛋白,进行sds-page和westernblot分析,鉴定foxp3蛋白及其融合标签myc、sbp、proteing结合肽的表达。结果显示,myc、sbp和proteing结合肽的抗体分别在ki小鼠treg细胞中检测到一条特异的68kda的目的条带,与foxp3(47kda)-融合标签(21kda)的理论值一致,而wtc57bl/6小鼠t细胞中未检测到此条带,说明标签与foxp3能正确融合表达。并且用igg和sbp抗体从转基因小鼠细胞裂解液pulldown的产物中可明确检测到myc蛋白(foxp3蛋白的一种标签),而从wtc57bl/6小鼠中则检测不到其表达,结果证实了各个标签可以正确融合表达。第四部分质谱分析候选foxp3相互作用蛋白为了分析foxp3的相互作用蛋白,我们分别用igg和sbp磁珠以及包被有myc抗体的磁珠进行亲和纯化。经质谱分析显示foxp3有60余种候选相互作用蛋白,包括foxp1、hdac2、nfatc2、cbfβ、gata3等,验证了小鼠体内foxp3蛋白确实存在大量相互作用的伙伴蛋白。第五部分免疫共沉淀验证foxp3相互作用蛋白质谱分析结果显示foxp3有大量候选相互作用蛋白,为了初步验证这些蛋白与foxp3蛋白是否相互结合,我们裂解ki小鼠cd4+cd25+gfp+treg细胞和wtc57bl/6小鼠cd4+cd25+t细胞,上清用各种标签或候选靶蛋白抗体包被的磁珠结合,磁珠分离法获得复合物,然后进行westernblot分析。结果显示,用包被有hdac2抗体、cbfβ抗体以及myc抗体的磁珠pulldownki小鼠和wtc57bl/6小鼠treg细胞裂解液后,分别能检测到cbfβ(21kda)、nfatc2(120kda)、gata3(50kda)和foxp1(90kda)以及融合myc标签的foxp3(68kda)蛋白。这些初步结果提示质谱鉴定的foxp3与其候选相互作用蛋白之间确实相互结合,为后续实验提供实验了基础。结论1.成功建立了tags-ires-gfp转基因小鼠。我们分别pcr方法鉴定了转基因小鼠tags标签成功插入;转基因小鼠的neo基因通过cre酶被成功敲除;建立了ki小鼠纯合子;而且foxp3基因及其融合标签均能正确表达。2.facs成功分选出高纯度的cd4+cd25+gfp+treg细胞。流式细胞分选的treg纯度超过96.8%,并用westernblot方法证实了tags标签在treg细胞中能够稳定表达。3.亲和磁珠纯化法获得了foxp3蛋白复合物,通过质谱分析和数据库搜索找到60余种foxp3候选相互作用蛋白。4.免疫共沉淀法初步鉴定了部分foxp3潜在相互作用蛋白。我们用免疫亲和磁珠法进行免疫共沉淀,初步证实了nfatc2、gata3、hdac2、cbfβ和foxp3在treg中有相互作用关系。综上所述,我们成功构建了Tags-IRES-GFP转基因(knock-in,KI)小鼠,并用Western blot、RT-PCR进一步鉴定了Tags标签和融合蛋白以及Foxp3基因mRNA的成功表达。通过质谱分析显示,Foxp3有许多相互作用蛋白,用Foxp3蛋白的标签Myc和潜在伙伴蛋白的抗体进行免疫共沉淀证实了Foxp3与Nfatc2、Gata3、Foxp1、Hdac2、Cbfβ等蛋白有相互作用,证实了Foxp3以复合物形式行使功能的假说,为这些蛋白对Treg细胞的后续功能研究奠定了基础。