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根表皮细胞核质中Ca2+浓度的振荡是豆科类植物对共生信号最早的反应之一。Ca2+尖峰信号(calcium spiking)的整合和解码涉及到两个蛋白,即：包括钙,钙调素依赖性蛋白激酶(calcium-and calmodulin-depedent protein kinase, CCaMK)和该蛋白的磷酸化底物CYCLOPS. CCaMK和CYCLOPS两种蛋白都含有多个可被磷酸化的位点,说明它们存在一个非常复杂的调控机制。但是,这些磷酸化位点与各种共生体系之间的相互联系还不清楚。本论文通过对Lotus japonicus har1-1进行乙基磺酸处理后,从har1-1抑制系中筛选得到Lotus japonicus sup11突变系。利用图位克隆技术和新一代测序技术,发现了两个连锁的突变位点,分别命名为ccamk-14和nph3-1。为了分离获得相应的单突变植株,将sup11与野生型的L. japonicus Gifu做回交。利用衍生酶切扩增多态性序列标记(derived cleaved amplified polymorphic sequence markers, dCAPS),对F2后代的504个单株进行了Har1-1、 CCaMK和NPH3位点的基因型分析,从中只获得了两个位点为纯合野生型而第三个位点为杂合型的个体。这些杂合体自交后,对其自交后代F3做了基因型检测,从而分别获得了相应的har1-1、 ccamk-14和nph3-1单突变植株。通过表型观察发现,nph3-1地上部分的生长略有减弱,但是与野生型Gifu相比,nph3-1对根瘤共生表型和丛枝菌根共生表型都没有明显的负面影响。通过功能互补实验,野生型L. japonicus的CCaMK基因能够使sup11幼芽上诱导生成的转基因毛状根恢复正常的丛枝菌根共生表现型,并且ccamk-14突变体所缺乏的根瘤侵染表型和丛枝菌根侵染表型也能被CCaMK基因恢复。因此,我们定义ccamk-14为导致表型缺陷的突变基因。Lotus japonicus ccamk-14突变系在根瘤菌和真菌的侵染过程中都存在缺陷,却能够正常启动根瘤器官的形成。在Mezorhizobium loti的侵染过程中明显增加了表皮的侵染频率,在M. loti和AM真菌(Glomus intraradices)的侵染过程中皮层细胞的侵染存在严重缺陷,表明ccamk-14突变在共生体系中有细胞特异性效应。ccamk-14突变使CCaMK结合钙调素(CaM)结构域中第337号位的丝氨酸被天冬酰胺取代。利用HPLC-MS/MS分析在E. coli中表达的L. japonicus CCaMK时,发现S337残基为另外一个能在体外被磷酸化的位点(潜在的自动磷酸化位点)。考虑到S337位于结合CaM的结构域中并且哺乳动物的多功能Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的结合CaM的结构域中的氨基酸残基的磷酸化阻碍了Ca2+/CaM的结合,因此木研究探测了S337残基是否参与了这一过程。通过定点突变构建了CCaMKS337N和CCaMKS337D,并在体外检测了它们与Ca2+/CaM的结合能力。研究结果表明：与野生型CCaMK相比,CCaMKS337N与Ca2+/CaM的结合能力提高了大约三倍。这说明S337残基被替换成N以后大大增加了这个结合能力。CCaMKS337D对CaM的结合能力反而大大的减弱了,表明磷酸化的模拟替代具有干扰效应。在非转基因ccamk-13的幼芽上诱导转基因的毛状根,并检测了L. japonicus CCaMK启动子调控下CCaMK和CCaMKS337D各自的表达情况,以此来探测CCaMKS337D的生物学相关性。结果表明：野生型的CCaMK在内源启动子的调控下表达后能够恢复ccamk-13突变体的根瘤共生体系和丛枝菌根共生体系,而CCaMKS337D却不能恢复这两种共生体系,说明CCaMKS337D突变使蛋白的生物学功能受损。与CCaMKS337N一样,在没有M loti的条件下,CCaMKS337D不能在转基因毛状根上白发形成结瘤。鉴于S337位点的修饰对CaM结合能力有影响,本研究测试了野生型CCaMK、 CCaMKS337N和CCaMKS337D与已知互作蛋白CYCLOPS的相互作用。定量酵母双杂交分析显示：失去激酶活性的CCaMKG30E与CYCLOPS的相互作用严重受损,而CCaMKS337N和CCaMKS337D与CYCLOPS的相互作用达到了野生型CCaMK与CYCLOPS相互作用的水平。由于ccamk-14改变了CCaMK对Ca2+CaM的结合能力,本研究检测了S337位点与体外CCaMK激酶活性的相关性是否涉及到自动磷酸化和底物磷酸化。因此,选择一个常用的人工磷酸化底物髓鞘碱性蛋白质和一个已知的CCaMK体外磷酸化底物CYCLOPS,对野生型CCaMK、两个突变型CCaMKS337N和CCaMKS337D的蛋白激酶活性进行分析。结果表明：分别加入Ca2+或者Ca2+/CaM时,CCaMKS337D的自动磷酸化水平和底物磷酸化水平完全不受影响,然而在CCaMK和CCaMKS337N中则能观察到依赖底物的反应。以CYCLOPS作为磷酸化底物时,加入Ca2+后野生型CCaMK的自动磷酸化活性大约增加了一倍,但是Ca2+/CaM的出现使野生型CCaMK的自动磷酸化活性又回到了基本水平,即Ca2+和Ca2+/CaM对CCaMK的体外自动磷酸化有着相反的效果。而CCaMKS337N和CCaMKS337D两个突变体中没有出现这个负调控模式。有趣的是,与MBP为底物时的情况不同,在Ca2+/CaM的刺激下CCaMKS337N对底物CYCLOPS的磷酸化更为敏感。CCaMKS337N能使底物CYCLOPS磷酸化的水平达到了野生型CCaMK的3倍。相反的,Ca2+的加入不能刺激CCaMKS337D对CYCLOPS底物的磷酸化,但是当加入Ca2+/CaM时,仅表现有轻微的提升。综上所述：所有的数据都显示第337号位的丝氨酸残基参与了Ca2+/CaM的结合以及CCaMK活性的负调控作用。如同从CCaMKS337D中得到的推断一样,S337的磷酸化很可能会阻止ca2+信号和限制Ca2+/CaM的结合,共生体信号以此来调节CCaMK的活性,而CCaMKS337N失去了这个能力。另外,我们将进一步构建实验以确定CCaMK激酶结构域中T265的磷酸化是否会进一步促进结合CaM结构域中S337的磷酸化。