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目的：从HCMV AD169中扩增出pp65(1006-1521nt)抗原优势表位基因，分别克隆至原核和真核表达载体，制备了pp65蛋白质疫苗和pp65 DNA疫苗；观察其诱导Balb／c小鼠产生的体液免疫应答和细胞免疫应答，并对影响DNA免疫效果的因素进行了初步探讨和优化：研究他们阻断HCMV先天性感染的免疫保护程度。为预防母体原发性感染，阻止先天性HCMV感染寻找新的有效途径。 方法：(一) 提取HCMV DNA，然后以其为模板扩增出pp65(1006-1521nt)基因片段，克隆至原核表达载体pET100-TOPO和pcDNA3.1-TOPO真核表达载体，分别在E．coli BL21和SP2／0细胞中进行外源目的基因的表达，鉴定其特异性和免疫原性。大量表达和纯化pp65目的片段蛋白质(蛋白质疫苗)；大量提取并纯化真核表达质粒pcDNA3.1-pp65 DNA(核酸疫苗)；(二) 为了观察其诱导Balb／c小鼠产生的体液免疫应答和细胞免疫应答，36只Balb／c小鼠随机分为A、B、C、D、E、F6组，每组6只。A组(pp65蛋白质疫苗组)每只小鼠初次分别经背部皮下多点注射50μl pp65蛋白(1μg／μl)+50μl CFA，于第2、4周分别经背部皮下多点加强注射50μl pp65蛋白(1μg／μl)+50μl IFA；B组(pp65 DNA疫苗组)每只小鼠分别在第0、2、4周经股四头肌注射pcDNA3.1-pp65质粒DNA200μg；C组(pp65 DNA疫苗和pp65蛋白质疫苗联合免疫组)每只小鼠分别在第0、2周经股四头肌注射pcDNA3.1-pp65质粒DNA200μg，在第四周经背部皮下多点注射50μl pp65蛋白质安徽医科大学硕士学位论文(1林g单l)+50林1 CFA;D组(pp65 DNA疫苗组+CpG)每只小鼠分别在第o、2、4周经四头肌注射200林9 pcDNA3，l一pp65质粒DNA和20林9 CpG;E组(空质粒阴性对照组)每只小鼠分别在第。、2、4周经股四头肌注射PcDNA3 .1空质粒200林g;F组(空白对照组)每只小鼠分别在第0、2、4周经股四头肌注射生理盐水200川。末次免疫后的第3d，眼眶采血，收集血清，间接ELISA法检测各组小鼠血清中的pp65抗体效价;同时，无菌取各组小鼠脾细胞，用重组pp65蛋白质疫苗作为抗原刺激，MTT法测定T淋巴细胞的刺激指数和脾脏的特异性杀伤细胞率;双抗体夹心ELISA法定量检测脾细胞上清中IFN一Y的含量。(三)为了研究它们阻断HCMV先天性感染的免疫保护程度SPF级Balb/c小鼠随机分为4组，每组3对，A组肌肉注射一00林l生理盐水，l周后，将HCMV AD一69株悬液按0.sml/只(100TCIos。)注射至SPF级雌雄小鼠腹腔内，B、C组为感染HCMv前1周分别接种200卜9 pp65质粒DNA;D组设定为正常对照组，HCMV感染后按1:1比例同笼饲养，逐日晨检查阴栓以确证其妊娠开始时间，B、c两组在孕7天用200拼9 peDNA3.卜pp65质粒DNA加强一次免疫，B、c两组在孕巧天分别用200林9 peDNA3.1一pp65质粒DNA和50协1 pp65蛋白质(1林g单l)+50林ICFA再加强一次免疫。以上各组在雌鼠临产(约为妊娠的第20d)前，眼眶取血检测pp65特异性抗体;剖腹取胎鼠，观察各组胎鼠生长发育状态;同时取胎鼠大脑皮质，母鼠脾细胞，作以下检测:(1)脑组织匀浆病毒分离;(2)脑组织石蜡切片HE染色光镜观察病理改变、透射电镜下观察亚细胞结构的改变;(3)免疫荧光检测HcMv立即早期PP“核抗原的表达;(4)原位杂交检测HcMv立即早期基因的表达。( 5)MTT法检测T细胞的增殖反应。结果:(一)成功构建了重组原核表达载体pETI 00一pp65和真核表达载体PcDNA3 .1一pp65，在BL21和sPZ/0细胞中均表达约为28KD的特异性和免疫原性的pp65蛋白片段;(二)pp65蛋白质、pp65 DNA疫苗、pp65 DNA疫苗+epo、pp65 DNA疫苗+pp65蛋白质疫苗片段联合免疫BALB/。小鼠，血清抗体效价分别为:A组l:80;B组l:32.48;C组1:179.59;D组l:157.21;E组为<l:10;F组为安徽医科大学硕士学位论文<1:10;刺激指数最高(扣除空白对照值)分别为:A组3.72月.34;B组5.43士1.56;C组6.76土1 .82;D组7.18士1.95;E组2.74士0.95;CTL杀伤率最高分别为(扣除空白对照值):A组32.04%士9.56%;B组56.86%士16.62%;C组71.00%士18.82%;D组73.58%士22.61%;E组23.58%士4.28%;IFN一Y分别为(扣除空白对照值):A组199.56士18.50ng/L;B组464.12士29.95ng/L;C组747.66士46.17ng/L;D组787.97士56.gong/L;E组100.06土9.76ngzL。(三)HCMv先天性感染的免疫保护程度SPF级Balb/c小鼠模型中，ELISA检测SPF级母鼠的抗体效价分别为:A组1:2.51;B组l:一2.69;C组l:50.79;D组<1:2。SPF级母鼠脾细胞刺激指数分别为:A组1.27士0.18;B组3.13士0.37;C组3.86士0.46;D组1.08士0.0165。A组子鼠脑组织匀浆病毒分离阳性，HCMV立即早期基因探针原位杂交显示子鼠脑内平均每个视野有4一5个阳性细胞，免疫荧光示HCMv立即早期pp65核抗原的表达，平均每个视野有3一4个阳性细胞，原位杂交和免疫荧光示B组子鼠HCMV立即早期基因和立即早期pp65核抗原的少量表达，平均每个视野为。一1个阳性细胞，c组及D组均无HCMV立即早期基因及立即早期pp65核抗原的表达，B组、C组及D组病毒分离均为阴性。病理学检测显示A组子鼠病理损伤明显，光镜下HE染色示脑血管均扩张充血，神经元数目明显减少，残有的神经元缺血性改变，间质水肿;可见软化灶及受染神经细胞核内及胞浆内HC