研究背景及目的：肝癌(hepatocellular carcinoma)是世界第七大常见肿瘤,在癌症相关死亡中排第三位；我国是世界上肝癌发病集中的国家,每年新发病例约占全球的45%。肝癌死亡率高,其诊断的金指标AFP在肝癌中只有70%左右的阳性率,如果能找到特异的蛋白或基因,这将对研究肝癌发病机制、新的治疗方法以及提高其早期诊断率具有重要的意义。糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase, GP)是糖原分解代谢的限速酶,糖原磷酸化酶脑型(Brain-type GP, PYGB或BGP)是其的一个亚型；PYGB主要在成人脑组织、胚肝组织和恶性肿瘤中表达,其功能一般认为是在应急状态为机体提供能量。Sato K等研究表明PYGB在鼠Novikoff和Morris3924A肝癌细胞系中表达明显增高,但在正常的肝脏和Morris hepatoma20不表达或表达极低。前期实验发现PYGB在肝癌细胞系中表达升高,其表达水平随着肿瘤恶性程度的增加而增高,这是否提示PYGB具有促进肝细胞癌的发生发展的功能,这方面的研究至今尚未见文献报道。一般认为PYGB功能是在人体应急状态时为机体提供能量,而众所周知,由于肿瘤细胞增殖生长旺盛,肿瘤常常处于缺血缺氧的状态。PYGB在肝细胞癌中表达的增加,这是否亦提示着在缺血缺氧的状态下,肝癌细胞能够得到更多的葡萄糖的供应,使肝癌细胞在缺血缺氧的环境下能更好的存活。此外,我们前期实验发现PYGB高表达组患者的无瘤生存期和生存期均较低PYGB表达组低。因此,我们设计该课题,研究PYGB在肝细胞癌中的生物学行为及可能作用机制,这对研究肝细胞癌的发病机制、提高早期诊断、预示患者的预后将有着重要的意义。实验方法：一、肝癌细胞系中PYGB的表达。多利肝癌细胞系的培养,收取细胞裂解液,应用western blot实验检测这些细胞系中PYGB表达水平；二、构建PYGB过表达及干扰的质粒或慢病毒,建立稳定的细胞系。三、PYGB在肝细胞癌中生物学功能研究。(1)增殖实验：CCK-8检测所建的PYGB高低表达的稳定细胞系在不同时间点的450nnm的吸光度值；(2)抗凋亡检测：TNFa和CHX孵育稳定细胞系细胞,分别收集0h、6h、12h的细胞裂解液,采用Wesretn blot方法检测PARP、caspase3等蛋白的表达情况；(3)克隆形成实验：将稳定细胞系细胞分别种至6孔板,3000个/孔,37℃5%C02孵箱培育,2-3周后观察克隆形成的情况。(4)迁移实验：A.划痕试验：显微镜下观察PYGB高低表达的稳定细胞系在Ohr、12hr、24hr同一点划痕问的距离。B.Transwell实验：PYGB高低表达的稳定细胞无血清培养基重悬,取1x105个种至transwell小室,小室下为含10%血清的培养基,24hr后多聚甲醛固定,结晶紫染色后显微镜下观察细胞的迁移情况。(5)裸鼠皮下荷瘤实验：将PYGB高低表达的稳定细胞系的细胞扩增培养,消化后重悬至每100ul培养基含0.5-1×107个细胞,裸鼠皮下注射100ul相应的细胞,观察肿瘤生长情况。IHC检测瘤体PCNA、PYGB等的表达情况。(6)抗氧化应急实验：A.CCK-8检测PYGB高低表达的稳定细胞系予或不予不同试剂(如H2O2、无糖培养基等)刺激下在450nm时的吸光度值；B.Western blot实验方法检测PYGB高低表达的稳定细胞系在无糖培养的条件下PARP、caspase3等凋亡相关的蛋白表达情况。四、PYGB在肝细胞癌中作用机制的探讨。(1)ROS的检测：用免疫探钊D2FAA标记细胞内的ROS,在荧光显微镜下观察ROS的数量。(2)caspase3活性的检测：采用caspase3活性检测的试剂盒检测PYGB高低表达的稳定细胞系中caspase3的活性。(3)hRIP1质粒的构建及鉴定；(4)采用免疫共沉淀(IP)实验方法检测RIP1与PYGB间是否有相互作用。(5) Real-time PCR实验方法检测IPYGB高低表达的稳定细胞系中EMT相关的蛋白的变化。结果：(一)PYGB在肝细胞癌中的表达及其作用。1、PYGB表达水平高低与肝癌细胞系的恶性程度密切相关,在低度恶性肝癌细胞系中,PYGB的表达水平较低,而在高度恶性的肝癌细胞系中,PYGB表达水平明显升高,即随着肝癌恶性程度的增加PYGB的表达升高。2、构建了PYGB过表达质粒,建立Hep1-6和NIH3T3过表达PYGB的稳定细胞系；构建干扰PYGB的慢病毒,建立MHCC97H和MHCC97L干扰PYGB的稳定细胞系。3、PYGB在肝细胞癌中的生物学行为研究：(1)细胞增殖实验示过表达PYGB细胞增殖增快,干扰PYGB细胞增殖减慢；(2)抗凋亡实验提示干扰PYGB,PARP剪切体增多；(3)细胞迁移实验提示过表达PYGB组肿瘤细胞迁移数目增多,而干扰PYGB组肿瘤细胞迁移数目减少。(4)克隆形成实验提示过表达PYGB组肿瘤细胞形成克隆数目增多,克隆体积大,而干扰PYGB组肿瘤细胞形成克隆数目少、克隆体积小；(5)裸鼠皮下荷瘤实验提示过表达PYGB组肿瘤体积较对照组增大,而干扰PYGB组肿瘤体积较对照组小；(6)抗氧化应急实验提示在H2O2或无糖等培养下,干扰PYGB细胞增殖减慢,PARP的剪切体增多。4、NIH3T3细胞裸鼠皮下荷瘤实验,过表达PYGB组表现为实体肿瘤生成,而对照组未见肿瘤生长。(二)PYGB在肝细胞癌中相关信号通路的研究。1、肿瘤细胞过表达PYGB组ROS产生较对照组少；H2O2刺激后,过表达PYGB组产生的ROS同样较对照组少；2、caspase3活性检测提示干扰PYGB后caspase3活性增高；予TNFa刺激后,干扰PYGB组的caspase3活性较对照组明显增高；3、构建RIP1质粒,免疫共沉淀实验结果提示PYGB与RIP1之间存在相互作用；4、Real-time PCR结果提示肝细胞癌干扰PYGB后与EMT相关的蛋白E-cadherin较对照组升高,而Viminten、Desmin较对照组降低结论：1、在肝细胞癌中,PYGB的表达水平与肝癌细胞系的恶性程度相关,PYGB表达的上调,肝细胞癌的恶性程度增强。2、PYGB可促进肿瘤细胞的增殖、抑制细胞凋亡坏死、使肿瘤细胞在氧化应激等环境下存活能力增强；PYGB使肿瘤细胞的迁移、克隆形成、成瘤能力增强。3、PYGB可能具有使细胞发生恶性转化,促使肿瘤形成的功能。4.作用机制上PYGB与RIP1结合,使ROS生成减少,caspase3活性减弱,从而抑制肿瘤细胞的凋亡；PYGB可促进EMT的发生。