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β-1,4内切木聚糖酶是水解木聚糖关键酶之一,在工业中应用广泛。研究发现,禾本科植物中存在蛋白类木聚糖酶抑制剂,可降低木聚糖酶的催化活性,进而影响其应用效果。本研究克隆得到XIP型水稻木聚糖酶抑制蛋白基因rixi,分别在大肠杆菌和毕赤酵母中成功表达,并研究重组RIXI抑制蛋白对不同来源11家族木聚糖酶的抑制作用。主要结果如下:1、克隆水稻XIP型木聚糖酶抑制蛋白基因rixi,并成功构建大肠杆菌工程菌。以日本晴水稻基因组为模板,设计特异性引物,克隆得到rixi基因（GenBank登录号:KY807992）,该基因的开放阅读框全长为915 bp,编码304个氨基酸残基,编码的蛋白理论分子量为33.9 kDa。rixi基因与载体pCold TF连接,在15℃下经IPTG诱导培养,并转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性表达子pCold-RIXI5,重组抑制蛋白reERIXI存在于胞内和分泌至培养基中,采用Ni-亲和层析树脂对reERIXI纯化;pCold TF在lac启动子的控制下合成的重组蛋白结合着引发因子,蛋白大小约为54 kDa。SDS-PAGE和Western Blot分析结果显示该重组抑制蛋白的分子量约为89.8 kDa,与理论值相近。DNS法检测木聚糖酶活性结果表明,reERIXI能不同程度抑制多种11家族内切木聚糖酶活性。其中,对截短型褐色高温单孢菌木聚糖酶A突变体TfxACD214（D19V-S64C-I114T）和解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶A突变体reBaxA50（S138T）催化活性抑制率分别为35.13%,61.98%。当reERIXI分别与TfxACD214和reBaxA50作用时间大于30 min,质量比分别为1:1,2:3时抑制率较高;reERIXI对TfxACD214和reBaxA50最适抑制温度分别为60℃和50℃,且重组抑制蛋白reERIXI有较高的热稳定性。2、rixi定向插入pPICZαA穿梭载体,成功构建毕赤酵母工程菌PPrixi9。rixi插入载体pPICZαA并转化GS115酵母感受态,经过Zeocin抗性筛选、PCR鉴定,获得酵母工程菌PPrixi9。PPrixi9经甲醇诱导培养72 h,Ni2+-树脂纯化后获得重组rePPRIXI9,SDS-PAGE和Western Blot分析结果可知rePPRIXI的分子量约为47.0 kDa。DNS法检测木聚糖酶活性结果表明,rePPRIXI对TfxACD214和reBaxA50的抑制率分别为30.09%,55.54%;当rePPRIXI与TfxA-CD214和reBaxA50质量比分别为1:3和1:2,作用时间大于40 min时抑制率较高;rePPRIXI9具有较高的热稳定性。3、通过内源荧光光谱分析和圆二色谱分析技术,初步探究抑制蛋白与酶蛋白相互作用的光谱特征,两种抑制蛋白（reERIXI5和rePPRIXI9）分别与木聚糖酶（TfxA-CD214和reBaxA50）分别相互作用而产生的荧光猝灭现象,且属于静态猝灭。其中reERIXI对TfxA-CD214和reBaxA50的表观结合常数分别为8.081×10-3(L·μmol-1),1.833×10-1(L·μmol-1),结合位点数分别为1.35748和0.70649,rePPRIXI9对TfxACD214和reBaxA50的表观结合常数分别为1.485×10-1(L·μmol-1),1.846×10-1(L·μmol-1),结合位点数分别为1.05085和0.86621。证明抑制蛋白与木聚糖酶之间有蛋白间的相互作用,其结合力较弱。圆二色谱的分析结果表明,抑制蛋白与酶相互作用后二级结构发生了变化,酶蛋白本身相对稳定的二级结构在于抑制蛋白作用后,产生了不稳定的无规则卷曲结构,结合荧光光谱的结论推断蛋白间的相互作用为氢键作用力。4、采用高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）研究reERIXI对木聚糖水解产物的影响。TfxACD214水解山毛榉木聚糖酶的水解产物为木二糖—木五塘,在与reERIXI作用后,木二糖与木三糖的产物浓度明显降低;reBaxA50水解山毛榉木聚糖的产物为木二糖-木六塘,在与reERIXI作用后,木二糖—木四糖的产物浓度明显降低,但水解产物类型无变化。5、利用酵母双杂交技术探究抑制蛋白与酶蛋白之间互作水平。成功构建融合蛋白,并杂交融合,在缺陷培养基中培养观察菌落生产情况,通过检测β-半乳糖苷酶的活力定量反应互作水平。结果表明抑制蛋白与酶蛋白之间有相互作用,其互作强度依次为:reBaxA50>reBaxA>TfxACD214>TfxACD,且与DNS法测定结果一致。由此可以证明,RIXI抑制蛋白对淀粉芽孢杆菌来源的木聚糖酶作用强度高于高温单孢菌属来源的木聚糖酶,其突变型木聚糖酶与RIXI抑制蛋白的作用强度高于野生型。