论文部分内容阅读
目的：1.分析葫芦素B（cucurbitacin B, CuB）对多克隆丝裂原激活的小鼠淋巴细胞活化、增殖、凋亡和γ-干扰素（IFN-γ）表达的影响，探讨其免疫调节作用的机制。2.分析葫芦素B（cucurbitacin B, CuB）对Jurkat T细胞增殖、自噬和凋亡的影响，探讨其抗肿瘤效应和作用机制。方法：1.经不同浓度CuB处理的小鼠淋巴细胞，在刀豆蛋白（Con A,5μg/mL）或者佛波醇酯（PDB,10-7mol/L）和离子霉素（Ion,0.5μg/mL）刺激后，以细胞计数方式观察CuB对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用；以流式细胞术分析CD69和IFN-γ的表达，以及亚二倍体峰和线粒体膜电位的变化；免疫印迹分析Caspase-3的活化水平。2.将不同浓度的CuB作用于Jurkat T细胞，用MTS比色法测定细胞的增殖率；用流式细胞术分析细胞周期、线粒体膜电位和凋亡的变化；用免疫组化方法检测LC3-II的表达情况；用免疫印迹方法测定细胞自噬和凋亡相关蛋白（LC3-II, Bcl-2, Caspase-3和PARP）以及细胞骨架相关蛋白（G-actin, F-actin和Cofilin）的表达水平。结果：1.细胞计数分析显示，CuB对小鼠淋巴细胞增殖的抑制呈剂量依赖关系。对细胞DNA含量分析表明，随着CuB浓度的增加，处于亚二倍体峰（即凋亡峰）的细胞数量增加。同样，经CuB处理后，早期活化标志CD69分子和IFN-γ在CD3+T细胞中的表达均受剂量依赖性抑制。JC-1染色法结果表明，10μmol/L CuB能显著地使小鼠淋巴细胞的线粒体膜电位发生下降（P <0.01）。免疫印迹分析表明，10μmol/L CuB处理细胞24h后，Caspase-3明显活化。2. CuB作用Jurkat T细胞48h后，MTS法测定的结果显示CuB对Jurkat T细胞的增殖呈剂量依赖关系，其半数抑制率为1.58±0.17μmol/L。细胞周期分析表明，CuB能诱导Jurkat T细胞发生G2/M期阻滞并形成多倍体细胞。流式细胞术分析表明，CuB能促使Jurkat T细胞的线粒体膜电位发生下降并诱导细胞凋亡。免疫组化和免疫印迹结果表明，CuB能诱导自噬相关蛋白LC3-II的表达并促进细胞骨架相关蛋白cofilin的活化。通过抑制CuB诱导的自噬后，细胞发生凋亡的比例增加。结论：1. CuB能够剂量依赖性抑制Con A或PDB+Ion诱导的淋巴细胞增殖或细胞因子的表达。10μmol/L CuB在抑制淋巴细胞活化标志CD69表达的同时，还能促进淋巴细胞发生凋亡。总之，CuB能够明显抑制小鼠淋巴细胞的增殖、活化和IFN-γ的表达，并可诱导淋巴细胞发生凋亡。这些可能是CuB发挥抗炎和免疫抑制效应的重要机制。2.CuB能够剂量依赖性抑制Jurkat T细胞的增殖并诱导细胞发生G2/M期阻滞。CuB还能诱导Jurkat T细胞的线粒体膜电位发生下降并诱导细胞凋亡。CuB能活化Cofilin并破坏Jurkat T细胞骨架。这些实验表明CuB是通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来发挥它的抗肿瘤活性，而这些作用很可能与CuB对细胞肌动蛋白动力学平衡的破坏相关。