新药研发是一个漫长而又耗时的过程,通常包括如下几个阶段:靶点的鉴别、先导化合物的发现、小分子化合物的结构优化、临床前药效学和毒性评价及临床试验等。其中靶点鉴别是药物发现过程的开始,也是最为关键的阶段之一。利用化学小分子的多样性,选择适当的活性小分子,设计合成能够高选择性地作用于靶点蛋白,同时探测蛋白质的功能、结构以及与活性小分子作用模式的探针——化学小分子探针,可以为重大疾病的诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构,从而为创新药物的发现奠定基础。近年发展起来的基于活性的蛋白质组学研究,结合点击化学技术,是运用设计合成末端带有炔基或叠氮基且同时还具有活性的小分子探针共价标记靶蛋白后,将改造后末端带有炔基或叠氮基报告基团(Reporter or Tag),如荧光素或生物素,通过点击化学连接到探针分子上,这样就可以成功标记、检测或用来纯化其作用的靶点蛋白。格尔德霉素是目前开发较为成功的HSP90抑制剂,具有很强的抗原虫和抗肿瘤活性。格尔德霉素通过竞争性结合HSP90的N-末端ATP/ADP结构域,特异性地抑制HSP90所必需的ATP酶活性,从而抑制了的分子伴侣功能,对肿瘤细胞的生长、生存、凋亡产生重要影响。本课题在已知的格尔德霉素抗肿瘤作用构效关系基础上,在其分子结构的17位引入末端炔基或叠氮基团,设计合成源自格尔德霉素,具有活性的探针(如可以选择性、特异性与HSP90相结合)。与经修饰、改造后带末端炔基的报告基团罗丹明B在点击化学条件下,与已经和靶点蛋白共价结合的探针分子相链接,以标记肿瘤细胞内的靶点蛋白。本论文的具体内容包括:1、格尔德霉素的发酵制备与分析鉴定在格尔德霉素的发酵过程中发现了6种形态菌落(GF1, GF2, GF3, MF1, MF2, MF3),分别对其做了发酵条件摸索。发现使用固体平板培养基培养时,用燕麦琼脂比较适合菌株缓慢生长,有利于后来的液体发酵培养。防止初级代谢过于旺盛,次级代谢反而受到了抑制,菌体容易老化失去活性。液体发酵培养超过6天,培养物变得十分粘稠,使得提取分离变得困难。因此用GF1作为种子接种在液体培养基,培养6天后,立刻进行提取分离为最佳发酵选择。后经提取纯化,最终得到产率较高,纯度大于95%的格尔德霉素。2、格尔德霉素化学小分子探针及报告基团RB1的设计与合成共设计合成了格尔德霉素化学小分子探针3个,通过与GA-FITC竞争结合HSP90α实验,发现G2与HSP90α具有较强的亲和作用(EC50=13nM)。设计合成了报告基团RB1。靶点蛋白标记实验表明,其非常适合用点击化学。3、G2-RB1-HSP90α用作高通量筛选(HTS)模型的建立利用G2-RB1-HSP90α建立了适合用作高通量筛选的模型:从结果可知,DMSO(v/v)含量不超过4%为佳。最后优化的条件为G2(2nM)与Hsp90α(30nM)亲和反应3小时,加入RB1(5nM)和CuI(1 nM),DMSO(v/v)含量不超过4%为佳。4、探针的抗肿瘤作用及与细胞靶点蛋白标记实验研究采用MTT法对G2的抗肿瘤活性进行评价;通过对比发现,设计合成的格尔德霉素G2化学小分子探针与格尔德霉素具有相似的抗肿瘤细胞增殖抑制作用;在细胞蛋白标记实验中,均采用FTC-133肿瘤细胞株;第一组给以不同剂量的格尔德霉素化学小分子探针,第二组给以不同剂量的格尔德霉素化学小分子探针和过量的格尔德霉素;当药物分别作用于靶点蛋白后,加入含有荧光标记功能的报告基团罗丹明B的点击化学配方,使报告基团与格尔德霉素化学小分子探针G2共价链接,以此来标记靶点蛋白。