活化后凋亡(activation-induced cell death, AICD)是淋巴细胞受到外来或自身抗原刺激后发生活化、增殖,并行使免疫功能后多数细胞的最终归宿,也是免疫系统负向调控的重要环节,有利于控制免疫应答的强度和维持免疫耐受。但是活化后凋亡的淋巴细胞如何诱导免疫负向调控还有许多未知之处。多项研究提示正常机体中静息的自体细胞凋亡后,会被巨噬细胞或树突状细胞(dendritic cell, DC)迅速吞噬和清除,并诱导免疫耐受,且这一过程的缺陷与多种疾病的病因相关。活化后凋亡淋巴细胞被清除的过程和对巨噬细胞或树突状细胞的影响尚不清楚。近年来研究发现树突状细胞中具有不同功能的亚群,能够正向或负向调控免疫应答。而不同DC亚群可以吞噬处理凋亡细胞产生不同的生理效应,能够诱导免疫耐受,也可促进免疫应答。前期研究显示,吞噬自体静息凋亡细胞的树突状细胞能够抑制免疫反应,并可能有如下机制参与其中。吞噬凋亡细胞使树突状细胞促炎性细胞因子分泌减少,而某些抑制性细胞因子释放增多,如IL-10、TGF-β、IDO等;吞噬凋亡细胞的树突状细胞可以诱导调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)的产生,通过Treg来负向调控免疫反应。DC吞噬凋亡细胞后产生免疫抑制的机制目前多处于争论之中。不同的模型可能会出现不同的效应。我们研究组前期采用脾脏基质细胞、脑小胶质细胞和肝基质细胞诱导DC分化形成DCreg,能够显著抑制免疫反应,其主要的抑制机制是分泌NO,并且发现NO对T细胞的增殖具有直接抑制作用。因此,我们采用GM-CSF/IL4体外培养的小鼠树突状细胞和经抗原刺激后发生凋亡的CD4+ T细胞为模型展开研究,旨在(一)探讨在免疫应答过程中,吞噬活化后凋亡淋巴细胞的DC是否能够形成调节性DC,对免疫应答产生负向调控作用;(二)这种吞噬凋亡细胞的DC是否分泌NO,其浓度是否能够对T细胞活化、增殖及功能产生抑制效应,以及DC产生NO的机制,。我们用体外培养的成熟的C57BL/6小鼠骨髓树突状细胞作为提呈细胞,在OVA323–339多肽存在的情况下,刺激经磁珠分离纯化的TCR转基因CD4+ T细胞(DO11.10×C57BL/6 F1小鼠)。CD4+ T细胞活化后约96小时,即有大量细胞出现活化后凋亡。我们采用荧光染色,流式细胞检测和透射电镜等方法验证了CD4+ T细胞的凋亡。将DC与凋亡细胞共培养72小时以上,获得吞噬凋亡细胞的DC(DCapo),并采用荧光显微镜和共聚焦显微镜来证实DC对凋亡细胞和凋亡小体的吞噬作用。用流式细胞分析对mDC和DCapo进行表型和吞噬功能的比较发现,经凋亡淋巴细胞处理后,DCapo的CD11c、MHC II类分子和CD40、CD80、CD86共刺激分子的表达明显下降,而CD11b的表达上升。细胞的吞噬功能也增强,与不成熟的树突状细胞类似。以上结果显示,DC在体外能够吞噬活化后凋亡的淋巴细胞,其生物学特性会发生显著变化。我们在体外采用抗原提呈系统来评价DCapo的抗原提呈功能及是否具有免疫抑制效应。在mDC刺激特异性CD4+或CD8+ T细胞的实验中,加入DCapo,用流式细胞术分别检测T细胞的数量和CFSE分裂峰,评价CD4+或CD8+ T细胞的活化和增殖情况。结果显示mDC能够显著刺激T细胞的增殖和分裂,而DCapo本身刺激T细胞增殖分裂的能力则很弱。DCapo能够显著抑制mDC刺激引起的的CD4+和CD8+ T细胞的增殖和分裂。我们将新鲜MACS分选的带有OVA特异性CD4+或CD8+ T细胞过继性回输到受体小鼠体内,然后再回输已经荷载抗原肽的mDC和/或DCapo刺激其增殖,观察DCapo在体内对抗原特异性免疫反应的作用。在回输3-4天后用流式细胞术检测外周血和脾脏抗原特异性T细胞的数量和CFSE分裂峰,结果与体外实验类似,DCapo在体内也表现为对CD4+和CD8+ T细胞增殖的强烈抑制作用。然后,我们探讨了DCapo发挥免疫抑制作用的机制。我们检测发现,吞噬了凋亡淋巴细胞的DC分泌大量的NO。先前的研究证实NO可以直接抑制CD4+ T细胞的增殖效应。我们在体外DCapo抑制mDC刺激抗原特异性的CD4+ T细胞的增殖分裂的实验体系中,分别加用NO供体(NOC-18)和NO拮抗剂(PBIT),培养4天后用流式细胞术检测T细胞的数量。发现在mDC刺激T细胞增殖组加用NO供体后能够显著抑制T细胞的增殖分裂。而在DCapo抑制mDC刺激T细胞增殖组中添加NO拮抗剂,DCapo对T细胞增殖的抑制作用能得到很大程度的逆转。这一结果说明NO在DCapo的免疫抑制作用中发挥了重要作用。DCapo可以通过NO直接抑制T细胞反应,但是DCapo是否还诱导Treg来间接抑制T细胞反应呢?为了分析DCapo的抑制作用是否与Treg有关,我们利用同时有Foxp3EGFP和DO11.10特异性TCR的杂交一代小鼠T细胞,来替换体外DCapo抑制mDC刺激的抗原特异性T细胞增殖反应实验中的抗原特异性T细胞,观察体外DCapo是否可以促进Foxp3EGFPCD4+ T细胞的增加或Treg参与其抑制作用。采用流式细胞术检测各组中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例的变化,结果显示各实验组间Treg比例并没有显著性差异。进一步的体内实验发现,活化后凋亡细胞、DCapo体内回输与PBS对照组间小鼠外周血的CD4+CD25+Foxp3+细胞比例也没有显著增加。结果表明,抗原信号诱导的T细胞活化后死亡所诱发的调节性DC的免疫抑制作用不是通过诱导Treg来产生的。既然DCapo能够通过NO来发挥直接抑制免疫反应的作用,那么DCapo是如何产生NO的呢?与凋亡细胞的作用是否有关呢?细胞凋亡的早期就有磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)暴露在细胞膜表面,是树突状细胞识别凋亡细胞的重要分子。研究提示凋亡细胞膜表面的PS与DC表面的受体结合后可以激活STAT3信号转导途径。而STAT3不仅是胞内的信号转导分子,同时也是转录激活因子。多项研究结果显示在正常细胞或肿瘤细胞,STAT3的激活可以促进多种细胞因子分泌和细胞表面分子的表达,包括IL-6, IL-10, TGF-β等等。这些细胞因子常常与DC的负向调控功能有关。而STAT3的活化是否和NO的释放有关目前尚不明确。我们的研究结果表明,经抗原信号刺激产生的凋亡T细胞能诱导DC细胞分泌NO,而NO是DCapo发挥免疫抑制效应的重要分子。因此我们试图分析活化后凋亡的淋巴细胞是否也能够使DC胞内的STAT3磷酸化,其活化是否与NO的生成有直接关系。我们采用Western Blot的方法对DCapo胞内的STAT3信号分子进行了蛋白检测,结果发现随着与凋亡细胞共培养时间的延长,DCapo胞内p-STAT3的表达也随之增强,从而增强了STAT3的转录活性。随着共培养时间的延长,iNOS的表达也逐渐上升,其趋势与p-STAT3一致,而且iNOS的蛋白表达水平和mRNA转录水平均可以被特异性p-STAT3抑制剂JSI-124所抑制。对DCapo分泌NO的检测也证实,JSI-124有抑制DCapo分泌NO的作用。以上结果说明活化后凋亡淋巴细胞对DCapo的诱导与DC胞内的STAT3信号通路相关,STAT3的磷酸化与iNOS的产生有很强的相关性。本课题研究发现,将活化后凋亡的淋巴细胞与DC细胞共培养能够诱导出调节性DC(DCapo),其CD11c、MHC II类分子和共刺激分子的表达明显下降,CD11b的表达上升,吞噬功能增强,同时能够显著抑制抗原特异性T细胞的增殖和分裂,符合调节性树突状细胞的特点;DCapo主要通过分泌NO来抑制抗原特异性T细胞的增殖,未能发现DCapo诱导Treg的产生或Treg参与DCapo的抑制作用;活化后凋亡淋巴细胞诱导DCapo的分子机制与STAT3信号转导途径的活化相关,并且STAT3的活化导致iNOS的转录增强,使的NO的分泌增加,NO直接参与了DCapo的免疫抑制机制。这些结果证实吞噬了活化后凋亡淋巴细胞的树突状细胞是一群具有免疫抑制表型和功能的调节性DC细胞,NO是其发挥免疫抑制作用的重要分子,活化后凋亡淋巴细胞诱导的DCapo胞内STAT3活化与iNOS的合成和NO分泌相关。我们研究的结果进一步阐明了活化后凋亡淋巴细胞对树突状细胞的作用,并有助于解释了活化后凋亡诱导免疫耐受的机制。