产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),是一种革兰氏阳性、产芽孢、杆状厌氧菌,广泛分布于自然界和多种动物肠道内,在一定条件下,可引家畜、野生动物和人类的多种疾病。该菌按照产生的毒素不同可分为五种血清型(A、B、C、D和E型)。由于该菌的致病性与其产生的毒素有关,因此按照细菌产生的主要毒素进行定型,对本病的诊断和流行病学监测就显得非常重要。本研究通过显微镜观察、血清中和试验、生化试验和PCR方法分离和鉴定了一株家畜体内的产气荚膜梭菌；建立了检测产气荚膜梭菌毒素的多重PCR诊断方法、荧光定量多重PCR方法和单克隆抗体夹心ELISA方法；其中用荧光定量PCR方法从家畜粪样中直接检测梭菌毒素,在国内尚属首次。另外,通过寡核苷酸介导的突变方法,在国内首次构建了产气荚膜梭菌ε毒素的一个无细胞毒性突变体,并用该突变体蛋白做了小鼠免疫保护试验。研究结果如下：(1)从宁夏某奶牛场急性死亡的奶牛组织和肠道中分离出一株细菌,该菌在厌氧条件下生长迅速,产酸产气：在鲜血琼脂平板培养基上,菌落为圆形、扁平光滑、边缘呈锯齿状以及周围有双溶血环。经生化试验、小鼠血清中和试验以及PCR检测最终鉴定为A型产气荚膜梭菌,并且将α毒素进行了克隆表达。(2)建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,用本方法检测多种细菌,只有产气荚膜梭菌呈现阳性反应,而其它梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性；将目标菌的肉汤培养液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×103 CFU／mL.用该方法可以检测动物粪便样品和肠内容物中的产气荚膜梭菌并直接确定其血清型,为产气荚膜梭菌临床诊断和分子流行病学调查提供了可靠的技术。(3)试验中制备了三株分泌抗产气荚膜梭菌a毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5A4、3H4和5H4,对它们的部分特性进行了鉴定,单抗亚型鉴定结果显示5A4、3H4和5H4抗体亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a。杂交瘤细胞经小鼠多次传代后进行效价检测,结果三株单抗都具有很好的稳定性。用5A4初步建立了单抗夹心ELISA方法,为产气荚膜梭菌a毒素的大量检测奠定了基础。(4)参考发表的序列建立了检测产气荚膜梭菌毒素基因的荧光定量多重PCR方法,该方法可直接从动物粪样中检测目标菌的毒素基因并对目标菌定型。在实验室对宁夏地区三个奶牛场采集的261份粪样用本方法检测。结果发现,261份样品中有176份样品存在产气荚膜梭菌毒素基因,根据毒素分型规则判断只有A型和D型产气荚膜梭菌,在176份阳性样品中有142份样品中含有cpb2基因,占总数的80.7%。利用荧光定量多重PCR方法对奶牛粪样中产气荚膜梭菌分子进行定型,这在我国是首次报道。(5)实验中克隆和表达了D型产气荚膜梭菌e毒素基因,并且采用寡核苷酸介导的突变方法,在国内首次构建了产气荚膜梭菌e毒素的一个突变体,突变体蛋白能在大肠杆菌(Rosseta)中获得表达,并且表达的蛋白能够被天然e毒素抗体所识别。用体外MDCK细胞分析法检测了此突变体蛋白的细胞毒性,结果表明,当e毒素蛋白第106位的组氨酸突变为脯氨酸后毒素蛋白的细胞毒性丧失,用此蛋白免疫小鼠后能产生特异性抗体,并且免疫小鼠能够抵抗1000LD50剂量的野生型e毒素攻击。该实验为进一步研究D型产气荚膜梭菌e毒素结构与功能的关系以及研制预防动物肠毒血症的基因工程疫苗奠定了基础。