目的:与内皮干细胞相比,外周血来源的过度生长内皮细胞(blood outgrowth endothelial cells,BOECs)富含血管新生和细胞黏附所需的蛋白,生物学特性更像内皮细胞。同时它克服了成熟的人脐血内皮细胞体外培养扩增量少和表型易发生改变的缺点,成为研究血管异常相关性疾病的新工具。本研究旨在建立从人外周血中体外培养、扩增BOECs,并进行鉴定的方法。方法:采集健康供者外周血,梯度离心获得单个核细胞,接种于胶原铺板的细胞培养皿上,EGM-2完全培养基培养4周。观察BOECs细胞的形态学特征,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达。分析BOECs细胞上清血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)多聚体分布,免疫荧光共聚焦鉴定细胞内VWF的贮存及VWF的刺激分泌。结果:体外诱导培养4周左右,出现克隆性生长的细胞集落,BOECs呈现“铺路石”样外观。经过3周左右的扩增后,过度生长的内皮细胞表达CD31、CD34、EPCR阳性,CD14、CD45、CD133表达阴性。收集BOECs细胞上清,进行VWF多聚体分析,与正常血浆相比VWF多聚体分布无差异。在荧光共聚焦显微镜下,BOECs细胞内贮存VWF,加入佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激后,细胞内VWF增加,细胞表面可见VWF丝状结构。结论:运用本实验方法我们在国内首次实现了人BOECs的体外培养、扩增及鉴定。该方法可以为血管性血友病(von Willebrand disease,VWD)发病机制的探讨提供天然的细胞模型,并可能为病人基因治疗提供新工具。目的:血管性血友病因子质或量的异常导致人类最常见的遗传性出血性疾病,即血管性血友病。国际血栓和止血协会建立的VWD数据库中已经登记了许多VWF基因突变,但是来自亚洲尤其是我国的资料较少。中国VWD患者VWF基因突变类型、基因型与诊断之间的关系值得进一步研究。方法:本文收集了38例VWD患者及其家庭成员的外周血标本,对它们进行VWF基因筛查,同时收集了患者的临床资料及实验室检查结果。结果:采集的38个样本中,1型VWD 12例,2A型6例,3型13例,临床无出血症状的健康携带者7例。2A型VWD患者VWF:RCo/VWF:Ag明显低于1型和3型VWD患者。1型VWD患者以杂合突变为主,3型VWD以复合杂合突变为主。共发现了30种VWF基因突变,包括错义突变、无义突变、缺失和插入突变、剪接位点突变及复杂突变。其中20种是未报道过的新基因突变。结论:我们筛查了23个VWD患者家系,发现了20种新的VWF基因突变,扩充了中国VWD患者基因数据库。同时研究发现VWF基因突变有助于VWD的诊断和分型诊断。这些新的基因突变导致VWD的发病机制值得进一步探讨,并将为VWD患者的精准医疗提供研究基础。目的:血管性血友病因子前导肽(VWF propeptide,VWFpp)在VWF的多聚化、细胞内转运及分泌过程中非常重要,它由VWF的D1和D2区组成。尽管已经报道了许多位于成熟VWF分子的基因突变,但是VWFpp突变的报道较少,而且其导致VWD发病的机制不甚明了。方法:我们瞬时转染并表达了全长野生型和突变体VWF,分析VWF多聚体、VWF基础和刺激分泌。用免疫荧光共聚焦显微技术和western blotting法分析了VWF在细胞内的定位。采用截短型VWF的二聚化模型进一步研究了全长VWF多聚化障碍的原因。结果:我们在3个无关的血管性血友病患者中发现了3个新的基因突变(p.Gly39Arg,p.Lys157Glu,p.Cys379Gly)和1个已经报道过的突变(p.Asp141Asn)。人胚胎肾293细胞系体外表达实验显示,4个突变均导致VWF多聚化障碍。与野生型D1D2D’D3片段比较,4个截短型突变体形成D’D3二聚体的量减少。突变体VWF的基础分泌及佛波酯刺激的调节分泌均减少。免疫荧光共聚焦和western blotting的研究结果显示突变体VWF滞留在内质网中。结 论:VWF D1区的错义突变降低了VWFpp氧化还原酶活性,从而导致VWF多聚化障碍。突变体VWF滞留在内质网中,降低了VWF基础分泌和刺激分泌,因而导致了携带这些基因突变的VWD患者的出血倾向。这将为今后前导肽突变的VWD患者精准医疗提供治疗靶点。