论文部分内容阅读
传染性喉气管炎(Infectious laryngotractheitis，ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各地，被OIE列为B类传染病。上世纪60年代，我国也发现本病。此后，相继在许多省市流行，给我国养禽业造成了严重的经济损失。目前国内外主要使用弱毒疫苗预防本病，但它们都存在着疫苗株毒力偏强、潜伏感染、易于返祖以及疫苗株和野毒株无法鉴别的缺点，从而不利于ILT的根除。随着分子生物学的发展，利用基因工程疫苗预防ILT已成为人们的共识。其中重组病毒活疫苗由于其自身优势，成为防制传染病的研究热点；而核酸疫苗也越来越受到研究者的关注。本研究利用鸡痘病毒弱毒疫苗株282 E4株为载体，构建了表达ILTV烟台株gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgG重链恒定区基因的重组鸡痘病毒；并构建了包含ILTV主要抗原基因的DNA疫苗，检测了两种疫苗单独或联合使用时，诱导鸡产生的体液免疫和细胞免疫情况。研究主要包括以下几个方面： 1．传染性喉气管炎病毒烟台株gB基因的克隆和DNA疫苗的构建 以传染性喉气管炎病毒(ILTV)烟台株基因组DNA为模板，根据已发表的ILTV SA-2株基因序列设计并合成1对引物，在上下游分别添加KpnⅠ和ApaⅠ酶切位点，PCR扩增出一条2.7kb的片段，测序结果表明：gB基因长2619bp，包含完整的阅读框架，编码873个氨基酸。将该片段亚克隆到pcDNA3.5真核表达载体中，酶切分析表明成功构建了真核表达质粒pcDNA-gB。参照《分子克隆》大量提取质粒pcDNA-gB转染cos-7细胞，间接免疫荧光表明该蛋白获得表达，为下一步DNA免疫奠定了基础。 2．目的片段的选取及重组鸡痘病毒转移载体pEF-gB-gD-IgG的构建 以传染性喉气管炎病毒(ILTV)烟台株基因组DNA为模板，根据已发表的ILTV SA-2株基因序列设计并合成2对引物，分别扩增其gB和gD的主要抗原表位基因，同时人工合成IgG重链恒定区第900～1400基因。在gB上游引物5’端添加ATG GCG，gD上游引物5’端设计一个9个氨基酸的linker(-GSLAGALGL-)，在合成的IgG重链恒定区基因3’端添加TAA，使gB及gD主要抗原表位基因与IgG重链恒定区基因连接后形成一个完整的阅读框架。将gB和gD片段分别亚克隆到pBluescript Ⅱ SK(+)中，得到重组质粒pSK-gB-gD。然后将从重组质粒pSK-gB-gD酶切回收得到的gB-gD