目的：恶性增殖和转移是肿瘤细胞的最主要特征。本项目研究Sine oculis homeobox homolog1(SIX1)对于宫颈癌细胞增殖和肿瘤转移的促进作用及其机制。方法：real-time RT-PCR检测基因的表达水平。蛋白印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫组化检测基因的蛋白水平。单荧光流式细胞术检测表面分子的蛋白水平。免疫组化分析体内淋巴管密度。采用Bioconductor edgeR、Onto-Tools以及Gene set enrichment analysis软件包对The Cancer Genome Atlas (TCGA)数据库来源的人宫颈癌测序数据进行生物信息学分析。流式细胞术检测细胞在不同细胞周期中所占的比例。Cell Counting kit-8和软琼脂集落实验用来分析肿瘤细胞的体外增殖。Transwell实验分析肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力。粘附实验分析细胞与细胞外基质(ECM)的体外粘附能力。明胶酶谱检测细胞分泌活性MMP2和MMP9的水平。流式细胞术检测检测肿瘤细胞的失巢凋亡。人淋巴管内皮细胞(HLECs)的迁移和成管实验分析SIX1对体外淋巴管生成的作用。宫颈癌原位移植模型和爪垫模型检测肿瘤细胞的体内淋巴结转移能力。实验性转移模型检测肿瘤细胞的对靶器官的粘附、渗出和形成转移灶的能力。活体生物发光成像以及荧光成像检测肿瘤的生长和转移。免疫沉淀研究蛋白质之间的相互作用。染色质免疫沉淀检测蛋白质与基因启动子的结合。结果：(一)在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中,SIX1的表达由人乳头瘤病毒的E7癌蛋白所诱导。SIX1表达的增高导致与DNA复制有关的多基因表达的上调,包括微小染色体维持蛋白复合体(MCM2、MCM3、MCM6), DNA聚合酶α-引物酶复合体(POLA1、PRIM1、PRIM2), clamp loader (RFC3, RFC4, RFC5), DNA聚合酶δ复合体(POLD3)以及DNA聚合酶ε复合体(POLE2)。与此相一致,SIX1的高表达促进G1至S期细胞周期进程,并促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤的生长。相应的,沉默SIX1可以减慢G1至S期细胞周期进程,并抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤的生长。重要的是,SIX1可以更有效地促进锚定非依赖的细胞生长,从而可能在肿瘤的侵袭浸润生长和转移灶中肿瘤细胞的生长起到显著的促进作用。(二)组织标本免疫组化显示,宫颈癌的淋巴管生成和淋巴结转移与肿瘤细胞高表达SIX1密切相关。SIX1的高表达在体内、体外都是通过增强VEGF-C的表达从而增强肿瘤细胞对淋巴管生成的促进作用。SIX1增强TGF-β诱导的SMAD2和SMAD3的激活,并且与SMAD通路协同促进VEGF-C的表达。SIX1与TGF-β协同促进肿瘤细胞表达VEGF-C的效应远远高于两者单独的作用。尽管TGF-β能促进VEGF-C表达,但是TGF-β1通过直接抑制淋巴管内皮细胞的成管,从而抑制淋巴管生成。然而,TGF-β1与SIX1协同促进的VEGF-C表达不仅直接促进淋巴管内皮细胞的迁移和成管,而且抵抗了TGF-β1对淋巴管内皮细胞的抑制效应。(三)SIX1促进α5和β1亚基的表达,而不调控其他与多种肿瘤预后相关的整合素的表达。S1X1通过上调α5β1表达从而促进肿瘤细胞的体外粘附和体内循环系统中细胞滞留的能力。通过上调α5β1的表达,SIX1也增强了ECM-α5β1介导的基因表达调控,包括提高活性MMP2和MMP9的分泌、上调抗凋亡基因(BCL-XL和BCL2)、下调促凋亡基因(BIM和BAX),从而增强宫颈癌细胞的转移能力。阻断α5β1,可消除SIX1对这些基因的表达调控,也消除了SIX1对肿瘤细胞侵袭能力的促进作用。并且,沉默a5也消除了SIX1在实验性转移和自发性转移模型中对发展转移灶的促进作用。结论：SIX1在DNA复制中起到主调控因子的作用,促进肿瘤细胞的增殖。SIX1通过与TGF-β通路协同促进VEGF-C的表达,从而促进淋巴管生成和淋巴结转移。同时,SIX1通过上调α5β1的表达,增强宫颈癌细胞的侵袭、转移能力。这些发现说明SIX1在宫颈癌的发生、发展和侵袭转移中起关键作用。这也提示S1X1可能作为评价宫颈癌增殖和转移能力的标志分子,也可考虑作为一个潜在的抗肿瘤治疗的靶点。