研究背景溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）是炎症性肠病的一种主要形式,在临床上主要表现为血便、腹痛和腹泻。自改革开放以来,我国溃疡性结肠炎的发病率迅猛增长,且现有的治疗只能求缓解,而无法治愈,这极大降低了患者的生活质量,也给患者和家庭带来了沉重的经济负担。基因易感性、免疫失调和饮食等许多因素已经被证明与溃疡性结肠炎的发病和进展有关。然而,现有的研究对与溃疡性结肠炎的病理过程仍缺乏足够的了解。肠嗜铬细胞（Enterochromaffin cells,EC）构成了肠道内分泌系统的主要成分。尽管EC细胞在数量上仅占所有肠上皮的1%,它却通过感知肠腔内容物、分泌5-HT和其他激素以及与神经和免疫相互作用等途径,在维持肠道稳态中发挥着至关重要的作用。然而,EC细胞在消化道上皮中不仅数量稀少,分布也十分离散,给相关研究带来了很大的难度。尽管近几年来单细胞测序和荧光激活细胞分选术等技术的迅速发展为EC细胞的研究提供了便利,但是,现有涉及溃疡性结肠炎的研究所报道的EC细胞相关的改变仍寥寥无几。受制于稀少的数量和单细胞测序不尽人意的测序深度,EC细胞在溃疡性结肠炎患者肠道中究竟发生了何种病理改变,对于疾病的发生和发展产生了何种影响尚无明确定论。空间转录组NanoString GeoMXDSP这一新技术的出现为相关研究提供了新的可能。通过在石蜡切片上使用免疫荧光染色标记感兴趣靶点,可以选取特定病变、解剖结构或细胞进行转录组层面的表征,具有空间选择性和理想的测序深度,因此可作为研究EC细胞的理想方法。因此,本研究拟分为三部分,立足于人类样本,借助nanoString GeoMX DSP技术对人类肠粘膜EC细胞转录组进行表征,并结合公开的单细胞测序和bulk转录组测序数据探究EC细胞相关基因和特异性标志物,以及UC患者肠道粘膜EC细胞转录谱及其功能改变,对发掘的靶点进行验证,并初步探索可能的作用机制。第一部分nanoString GeoMXDSP技术表征人类EC细胞研究目的:作为肠道内分泌系统的主要组成部分,EC细胞在肠道稳态的维持中发挥重要作用。然而,EC细胞数量极少且分布离散,给相关研究带来了技术上的困难。以往EC细胞转录谱的研究较少,且绝大多数在动物中进行。我们在石蜡包埋的肠活检标本上应用nanoString GeoMX DSP这一新技术,以探究该技术对肠粘膜EC细胞的转录谱的检测能力。研究方法:通过免疫组织化学染色对78例结肠活检组织的EC细胞数量进行预评估。将具有足够数量EC细胞的样本制成石蜡包埋的组织芯片。使用nanoString GeoMX DSP分别对EC细胞和上皮背景的转录组进行测序。对测序数据进行质量控制后,计算各靶点平均测序计数和定量限,进行主成分分析,并比较了TPH1和CHGA在各组的表达量。研究结果:1.使用nanoString GeoMXDSP检测了 19个样本的约1.8万个靶基因的表达量。其中4个样本在质量控制过程剔除。各个样本中高于定量限的靶点中位数为3627,最高为7267,最低为 1355。2.主成分分析发现各组间基因表达存在明显差异。3.EC细胞组具有远高于上皮背景的EC经典标记物TPH1和CHGA的表达水平,证明nanoString GeoMX DSP测序结果的可信性。研究结论:本研究使用nanoString GeoMX DSP技术表征了健康人和溃疡性结肠炎患者的EC细胞。该技术可对人肠粘膜EC细胞转录组进行准确表征,是EC细胞转录组研究的理想工具。第二部分 联合应用nanoString GeoMX DSP和单细胞测序技术表征EC细胞相关基因研究目的:EC细胞是肠道内分泌系统的主要组成部分,在肠道稳态的维持中发挥重要作用。由于数量少且分布离散,以往一直缺乏对人类EC细胞转录谱的研究。特异性标志物的缺乏又进一步阻碍了相关研究的进行。我们使用nanoString GeoMX DSP和单细胞测序技术探索人肠黏膜EC细胞独特的基因表达模式和特异性基因表达,并在蛋白水平进行验证。研究方法:对nanoString GeoMX DSP结果中健康受试者EC细胞上皮背景进行差异表达分析。使用加权基因共表达网络分析构建EC相关共表达网络并鉴定枢纽基因。从Single Cell Portal获取包含30个结肠活检标本的单细胞测序数据集,使用Seurat标准流程对数据进行了过滤、降维和聚类。根据CHGAhigh TPH1high PCSK1Nhigh PYYlow GCGlow对EC细胞注释后,进行差异表达分析,并与DSP测得的差异基因进行比较。使用免疫荧光染色对相关靶点的表达进行验证。研究结果:1.在健康受试者结肠中,EC细胞与上皮背景相比,鉴定出上调基因10个,包含CHGA、TPH1、PCSK1N、SST等;下调基因 11 个,包括PHGR1、GUCA2A、KRT20、SLC26A3、FABP1 等。2.WGCNA分析发现包含TPH1、CHGA、SCAMP5、IGFBP3等35个基因的共表达网络与EC细胞关联,其功能涉及“5-HT代谢过程”、“胰岛素样因子Ⅰ结合”、“初级氨基酸复合物代谢过程”等生物学通路。得到SLC38A11、CRYBA2、MITF等EC细胞相关的枢纽基因17个。3.结合DSP和单细胞测序数据鉴定出EC细胞相关基因9个（RGS2、PCSK1N、CHGB、CHGA、TPH1、CRYBA2、SCG5、IGFBP3、DDC）,并发现了 RGS2、TPH1、SLC38A11、C6orf141、CHGB在EC细胞上的特异性表达。4.免疫荧光染色证实了 RGS2和CHGB与人类结肠EC细胞的共定位。研究结论:1.EC细胞具有独特的基因表达特征。本研究将RGS2、PCSK1N、CHGB、CHGA、TPH1、CRYBA2、SCG5、IGFBP3和DDC鉴定为EC细胞相关基因。2.包含TPH1、CHGA、SCAMP5、IGFBP3等35个基因的共表达网络与EC细胞关联,其功能主要集中于激素的合成、转运与分泌。3.除经典标志物 TPH1和CHGA以外,RGS2、SLC38A11、CRYBA2和C6orf141等基因在人类EC细胞的高度特异性表达,为后续研究提供了新的靶点。第三部分 nanoString GeoMX DSP表征人类肠嗜铬细胞在溃疡性结肠炎发病中的机制研究研究目的:EC细胞通过内分泌、免疫和神经等途径在维持肠道稳态中发挥重要作用。然而,对于EC细胞在溃疡性结肠炎中的角色,以往研究仅局限于5-HT和CHGA的分泌。本研究拟分析溃疡性结肠炎患者肠道EC细胞转录和功能的改变,探究EC细胞在溃疡性结肠炎中的作用及机制。研究方法:分别在DSP和公开的单细胞测序数据集中鉴定溃疡性结肠炎患者和对照结肠EC细胞的差异基因,对其中的EC特异性基因CHGB进行RT-qPCR验证。对差异基因使用GO和KEGG进行了基因集富集分析。对溃疡性结肠炎患者和对照的上皮EC细胞的数量进行计算和比较。使用ChEA3进行转录因子富集分析。从Gene Expression Omnibus获得公开的溃疡性结肠炎患者bulk转录组测序数据集,进行EC相关基因和肠屏障相关基因的相关性分析。研究结果:1.在DSP测序数据中,与健康对照相比,溃疡性结肠炎患者EC细胞中发现上调基因49个。其中CHGB的上调与单细胞测序结果一致,并在RT-qPCR中得到了验证。2.健康状态下,EC细胞与上皮细胞相比,上调通路主要涉及基因表达、蛋白合成与分泌、生物胺合成等通路;下调通路主要与物质吸收有关。溃疡性结肠炎患者EC细胞感受化学及机械刺激的功能显著下调,激素分泌及与神经相互作用的功能增强,获得了抗原递呈功能。3.与健康对照相比,UC患者非炎症区域上皮EC细胞数量显著升高。4.MYRFL、IRF9、ISX、IRF7和BATF2等转录因子与溃疡性结肠炎患者EC细胞功能改变有关,其中ISX和ATOH2与EC细胞特异性差异基因CHGB上调有关。5.EC细胞标志物CHGB、GCLC、DDC和RGS2与UC患者肠道机械屏障蛋白CLDN2表达水平高度相关。研究结论:1.EC细胞在生理状态下具有特化的蛋白分泌功能。溃疡性结肠炎患者的EC细胞出现如下功能转换:1)感受刺激的功能出现缺陷;2)分泌功能上调;3)通过抗原递呈直接参与免疫过程。2.溃疡性结肠炎患者结肠中,在转录因子ISX和ATOH2的调控下,EC细胞出现数量增多和CHGB分泌上调,并参与调节溃疡性结肠炎肠道机械屏障功能。CHGB可能为UC患者改善肠屏障功能、促进黏膜愈合和控制复发的重要靶点。