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自2015年来,由高致病性血清4型禽腺病毒（FAdV-4）引起的包涵体肝炎与心包积液综合征在国内各个省份大规模爆发。同时,近年来FAdV-4在全球范围流行,FAdV-4感染导致的发病率和死亡率高达30-80%,对全球养禽业造成了巨大的经济损失。然而,目前对高致病性FAdV-4的感染机制知之甚微,且尚无商品化针对FAdV-4特异性抗体检测的血清学技术。本研究靶向FAdV-4的表面纤突蛋白Fiber-1以及Fiber-2,解析了 Fiber-1通过其Shaft+knob结构域直接介导FAdV-4感染机制,评价了 Fiber-1的knob结构域免疫保护效果,鉴定了 Fiber-1的互作蛋白14-3-3ε,获得了纯化的Fiber-1以及Fiber-2融合表达蛋白以及创制了检测FAdV-4特异性抗体的间接ELISA与竞争ELISA技术。研究结果与发现为进一步有效免疫防控FAdV-4感染提供了靶点与技术支撑。1.Fiber-1的Shaft+Knob结构域直接介导FAdV-4感染为了鉴定在FAdV-4的纤突蛋白Fiber-1与Fiber-2中,是哪个Fiber蛋白直接介导FAdV-4的感染,本研究在对Fiber-1和Fiber-2进行真核表达和原核表达的基础上,通过超感染抗性试验和重组蛋白干扰试验等进行探究,结果发现Fiber-1直接介导FAdV-4的感染,而不是Fiber-2。利用Fiber-1不同截短体进行的超感染抗性试验表明,Fiber-1直接介导FAdV-4感染依赖于Shaft+knob结构域。同时,以表达的重组蛋白His-Knob为免疫原制备的小鼠多抗在体外能够对FAdV-4的感染具有中和活性。进一步将重组蛋白His-Knob免疫鸡群后进行的攻毒免疫保护试验证明,His-Knob能对野毒FAdV-4攻毒提供良好保护。His-Knob免疫鸡群攻毒后,未出现任何临床症状病理变化,且能有效阻断病毒排毒。以上结果不仅证明了 Fiber-1及其Shaft+knob结构域在介导FAdV-4感染中具有重要作用,也证明了重组蛋白His-Knob可作为一种亚单位候选疫苗用来免疫防控FAdV-4感染。2.发现FAdV-4的Fiber-1能与宿主细胞蛋白14-3-3ε有效互作Fiber-1能通过其Shaft+knob结构域直接介导FAdV-4感染证明Fiber-1是FAdV-4感染细胞时与细胞受体结合的重要病毒蛋白。最近国内学者鉴定出了FAdV-4的Fiber-1能与细胞蛋白CAR结合介导FAdV-4感染。为进一步鉴定及探究与Fiber-1互作的宿主蛋白在FAdV-4感染与致病中作用,本研究利用抗Fiber-1蛋白特异性单克隆抗体3B5对转染pcDNA3.1-F1以及感染FAdV-4的LMH细胞裂解物进行了免疫沉淀,通过银染、质谱分析以及Western blot等鉴定与Fiber-1互作的宿主蛋白。结果发现FAdV-4的Fiber-1能与宿主细胞蛋白14-3-3ε有效互作。利用原核表达产物免疫小鼠制备的抗重组蛋白His-14-3-3ε多抗可以有效识别LMH细胞中的内源性的14-3-3ε蛋白。14-3-3ε属于14-3-3蛋白家族。14-3-3ε蛋白在细胞的信号转导中起着至关重要的作用,直接参与调节蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的活性。虽然在FAdV-4易感细胞LMH中高表达14-3-3ε-Flag对FAdV-4的复制没有明显的影响,Fiber-1与宿主蛋白14-3-3ε互作的发现和抗His-14-3-3ε小鼠多抗的成功制备为进一步探究Fiber-1在FAdV-4感染致病中的作用及机制提供了新的宿主靶点和生物材料。3.创制检测FAdV-4抗体的间接ELISA技术为建立检测FAdV-4抗体的快速血清学诊断技术,本研究以纯化的重组蛋白GST-Fiber-1和GST-Fiber-2为包被抗原,建立了两种检测FAdV-4抗体的间接ELISA（iELISA）方法,并对iELISA各参数进行了优化。特异性检测发现,两种iELISA仅能检测出抗FAdV-4和FAdV-10的阳性血清,而与所检测的抗其他血清型 FAdV（包括 FAdV-1,FAdV-2,FAdV-3,FAdV-5,FAdV-7,FAdV-8b,FAdV-9 以及 FAdV-11）以及其他病原（包括 ALV-J,CAV,IBV,IBDV,NDV,EDS以及H9N2）抗体均不反应。重复稳定性试验发现两种iELISA批间重复和批内重复的变异系数均低于10%。更重要的是,两种iELISA能够有效的检测出感染FAdV-4以及免疫FAdV-4疫苗鸡群中抗FAdV-4特异性抗体。与Bio-check 商品化检测试剂盒比较,这两种 iELISA 具有更好的检测灵敏度。本研究建立的两种基于GST-Fiber-1和GST-Fiber-2建立的两种检测FAdV-4抗体的iELISA方法为临床上FAdV-4感染检测以及疫苗的免疫监测提供了技术,具有良好的应用前景。4创制检测FAdV-4抗体的竞争ELISA技术为建立更便捷的检测FAdV-4抗体的血清学诊断技术,本研究利用纯化的GST-Fiber-2为包被抗原,HRP标记的抗Fiber-2蛋白特异性单克隆抗体3C2为二抗,建立了检测FAdV-4特异性抗体的竞争ELISA方法（cELISA）,并对该cELISA各参数进行了优化。在cELISA中,当样品抑制率PI≥31%时,则判定为阳性。特异性检测发现,该cELISA仅能检测出抗FAdV-4和FAdV-10的阳性血清,而与所检测的抗其他血清型FAdV（包括FAdV-1,FAdV-2,FAdV-3,FAdV-5,FAdV-7,FAdV-8b,以及 FAdV-11）以及其他病原（包括 ALV-J,IBV,ARV,NDV,EDS以及H9N2）抗体均不反应。重复稳定性试验发现两种iELISA批间重复和批内重复的变异系数均低于10%;且该cELISA与Bio-check商品化试剂盒相比,更具检测特异性。具有良好特异性及稳定性的检测FAdV-4特异性抗体的cELISA技术的建立为临床上不同家禽物种FAdV-4感染检测以及疫苗的免疫监测提供了快捷技术,具有良好的应用前景。