研究背景:恶性肿瘤严重威胁着我国居民的生命健康,化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一,但目前限制化疗药物（例如紫杉醇或喜树碱）临床运用的主要因素是严重的毒副作用和耐药的不断发生。利用化学修饰技术对传统的化疗药物进行改造并利用纳米载体递送来降低化疗药物毒性是目前肿瘤药物研究的热点之一。前药技术是指通过对原药进行一定的化学修饰,形成了暂时的化学耦连物,该耦连物可以在体内经酶促或非酶催化化学反应,释放原药而发挥作用。将化疗药物进行修饰构建前药可以提高药物与纳米载体（例如脂质体或聚合物载体）的相容性。使用纳米载体递送这些前药时能延缓有效成分的释放,延长体内血液循环时间,改善药代动力学（PK）特性。使用纳米载体联合递送化疗药物和抗血管分子靶向药也是肿瘤治疗的重要策略之一,能有效发挥协同抗肿瘤效果,抑制肿瘤耐药发生,减少单药使用剂量并降低毒副作用。目的:第一部分:将紫杉烷类衍生物卡巴他赛与长链不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）共价连接构建卡巴他赛前药（DHA-Cabazitaxel）,再探索该前药与脂质成分在水中组装成稳定的前药脂质体（Lipoprodrug）的能力。在体外评估该脂质体的肿瘤细胞毒性及探索可能机制。在体内多种动物模型上评价该脂质体的肿瘤靶向性、肿瘤组织分布情况、PK特性、抗肿瘤疗效及生物安全性。第二部分:将伊立替康活性产物7-乙基-10-羟基喜树碱（SN38）与聚合物聚乳酸（PLA）共价连接构建SN38前药（p SN38）,探索这该前药与双亲性聚合物m PEG-PLA在水中组装成聚合物纳米药物（nanoparticles,NPs）的能力。再筛选能与p SN38通过非共价相互作用被稳定在基于前药的NPs中的抗血管小分子抑制剂。在体外实验中评价该NPs对肿瘤细胞的毒性,对血管内皮细胞（HUVEC）功能的影响及机制。在体内多种小鼠模型上评估该共载纳米体系抑制肝癌肿瘤生长和转移的能力及可能机制。方法:第一部分:将卡巴他赛与DHA通过酯键连接进行不饱和脂肪酸化构建DHA-Cabazitaxel,再与脂质成分(卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000)通过乙醇注入法构建稳定的前药脂质体颗粒（Lipoprodrug）。在体外进行该脂质体的粒径、电位、电镜观察及药物释放等表征。细胞上评估该脂质体在肿瘤细胞内的内吞情况。利用MTT法、流式凋亡、流式周期、蛋白印迹、微管染色等方法在体外评估该脂质体对肿瘤细胞的毒性及可能机制。在荷瘤模型上进行活体成像及药物组织分布实验研究该脂质体对肿瘤组织的靶向性及在肿瘤组织内的分布情况。在SD大鼠上研究该脂质体的PK情况。再分别在前列腺癌细胞DU145和黑色素瘤细胞A375起源的移植瘤（CDX）模型及黑色素瘤病人起源的肿瘤组织异种移植瘤（PDX）模型上评价该脂质体的抗肿瘤疗效和毒性。最后在健康小鼠上进行该脂质体的生物安全性评估（包括器官毒性、骨髓抑制和肝肾毒性等）。第二部分:将SN38与PLA通过酯键连接构建SN38前药后与双亲性材料m PEG-PLA通过纳米沉淀法构建稳定的细胞毒NPs。再筛选能稳定包裹于该NPs的抗血管酪氨酸激酶抑制剂,构建两者共载纳米药物s TKI-p SN38。利用分子动力学（MD）模拟分析该共载纳米体系内p SN38与抑制剂的相互作用。体外对该NPs进行粒子表征和药物释放表征。利用MTT法研究了s TKI-p SN38的肿瘤细胞毒性。也利用成管实验、细胞迁移和侵袭实验等研究该NPs对血管内皮细胞功能的抑制和机制。体内进一步利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型探究s TKI-p SN38的血管新生抑制能力。在肝癌细胞Huh-7移植瘤动物模型上研究该NPs对肝癌的抑制作用及可能机制。在肝癌细胞H22爪垫移植瘤模型上进行药物体内成像和药效试验分别研究该NPs的组织分布和对肿瘤原发灶及转移灶的治疗效果。结果:第一部分:DHA-Cabazitaxel能与脂质成分在水中形成稳定的粒径约为130 nm左右,电位为-29.33±7.24 m V的前药脂质体,电镜下观察该脂质体为球型单分散体系。该脂质体在体外可以实现有效成分的缓释效果。细胞实验证明Lipoprodrug可以被肿瘤细胞有效内吞。也证明了Lipoprodrug具有与游离型卡巴他赛类似的细胞毒性,而且是通过抑制微管解聚,诱导细胞G2/M期阻滞并激活经典的Caspase通路介导肿瘤细胞凋亡。体内成像证明了该脂质体具有很好的肿瘤靶向性,能向肿瘤部位有效蓄积。药物的组织分布研究发现Lipoprodrug在肿瘤组织的分布显著高于传统剂型卡巴他赛。PK分析证明了相较于游离的卡巴他赛,前药脂质体明显延长了卡巴他赛的半衰期。在两种肿瘤CDX模型以及黑色素瘤PDX模型上也都证明了前药脂质体具有更优越的疗效和安全性。在PDX模型上,Lipoprodrug在对小鼠体重无明显影响的前提下可使5只鼠中有1只达到肿瘤治愈的效果。相比之下,游离型卡巴他赛给药不仅不能诱导肿瘤完全消除,还在给药的第8天使小鼠体重下降大于20%。体内安全性研究表明该前药脂质体至少将卡巴他赛在小鼠体内的最大耐受剂量提高了10倍,也明显降低了卡巴他赛的器官毒性、骨髓抑制及肝肾毒性。第二部分:成功构建p SN38前药后,通过筛选得到抑制剂阿帕替尼（Apatinib）能与p SN38稳定包裹于m PEG-PLA中形成稳定的粒径为40 nm左右、电位为-0.19±0.20 m V的共载NPs。该NPs在PBS溶液中实现了抗血管药物Apatinib和细胞毒药物SN38的先后顺序释放,而在有酯酶存在的环境中（例如肿瘤细胞裂解液）可快速释放SN38发挥作用。MD模拟发现p SN38与Apatinib间具有π-π堆积和氢键等相互作用,通过这些非共价相互作用将Apatinib稳定在包载p SN38的细胞毒纳米药物中。MTT实验上证明该NPs具有与游离SN38类似的肝癌细胞毒性。体外实验也证明s TKI-p SN38能保留Apatinib抑制HUVEC成管、迁移和侵袭的能力,而且是通过抑制VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥作用的。CAM模型研究发现s TKI-p SN38处理的CAM血管分支数明显少于未处理组。以上结果证明该共载NPs具有抑制血管新生能力。在肝癌Huh-7移植瘤模型上,单次注射s TKI-p SN38即显示了比分别装载混合递送剂型更好的强效肿瘤抑制效果。爪垫移植瘤模型上的近红外成像结果提示该共载NPs的肿瘤靶向能力明显高于游离型药物,而且不仅能靶向原位的肿瘤,还能高靶向于肿瘤附近的淋巴结。在该模型上的药效研究提示该联合纳米给药策略能同时有效抑制原位肿瘤和肿瘤附近的淋巴结转移灶的生长,可有效抑制肿瘤的转移和发展,在一定程度上减少了耐药的发生。结论:本研究将化疗药物卡巴他赛和SN38分别与DHA和PLA共价耦连构建脂质前药和聚合物前药,该前药的建立显著提高了化疗药物与载体的相容性,可分别与脂质成分和双亲性聚合物组装构建成稳定的前药脂质体和前药聚合物NPs。前药脂质体能增加卡巴他赛在体内递送时的稳定性,显著改善卡巴他赛的PK特性和提高肿瘤内的药物分布,增强抗肿瘤效果的同时降低药物毒性。前药聚合物NPs既可以实现抗血管小分子抑制剂Apatinib与化疗药物SN38的合理联用,实现两者在肿瘤部位的时空可控顺序释放,提高两者协同治疗肝癌的能力,还可以通过靶向淋巴结抑制肝癌的转移。以上两种基于前药的纳米载药系统及联用策略为肝癌及其他肿瘤治疗研究提供了新的方案和思路。