粒细胞集落刺激因子调控microRNA-146a/CXCR4表达在预激方案中的作用

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研究目的随着诊疗技术的进步,急性髓细胞白血病(AML)化疗缓解率已明显提高,但老年、复发/难治性、继发性AML患者的预后仍较差。由阿糖胞苷、阿霉素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)组成的CAG方案已广泛应用于这些患者,并取得较好的疗效。但G-CSF在预激方案中的作用仍不甚明确,本文将对潜在的G-CSF削弱基质细胞介导的白血病耐药及可能机制进行研究。设计和方法通过建立HS-5/HL-60共培养体系,模拟骨髓基质细胞与白血病细胞之间的相互作用。利用Transwell实验研究细胞趋化、共培养技术研究细胞粘附、CCK-8法检测活力、Annexin V检测凋亡、流式细胞术检测细胞表面膜蛋白、蛋白印迹法检测总蛋白、实时定量PCR(RT-PCR)检测基因表达等,研究了基质细胞对白血病细胞有无保护作用、G-CSF能否打破这种保护作用及相关的信号机制。实验结果第一部分HS-5细胞能够趋化、粘附HL-60细胞,而G-CSF和(或)CXCR4特异性拮抗剂AMD3100能够部分阻断此过程。与HS-5上清(非直接接触)或HS-5细胞(直接接触)共培养时,HL-60细胞凋亡减少(包括自然凋亡和药物诱导凋亡)、活力增加;G-CSF和(或)AMD3100能部分逆转HS-5的保护作用(凋亡增加、活力降低);G-CSF和AMD3100具有协同效应;与非直接接触共培养相比,直接接触共培养对HL-60的保护作用更加明显。HL-60细胞单独培养时,G-CSF和(或)AMD3100对HL-60细胞的活力、凋亡无明显影响。第二部分G-CSF作用于HL-60细胞后,能够明显降低HL-60细胞膜表面CXCR4蛋白、总CXCR4蛋白和CXCR4 mRNA表达,同时上调micro RNA-146a(mi R-146a);CXCR4与mi R-146a之间存在负性相关关系。AMD3100仅降低膜表面CXCR4表达,而对总CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA和mi R-146a表达无明显影响。第三部分G-CSF在上调mi R-146a、降低CXCR4 mRNA表达同时,上调NF-κB P50、P65 mRNA表达;与单独G-CSF处理相比,NF-κB抑制剂血根碱联合G-CSF处理能够部分逆转G-CSF的作用;血根碱单独处理对NF-κB P50、P65、mi R-146a和CXCR4 mRNA无明显影响。G-CSF处理后,NF-κB p50、p65、p-IκB蛋白表达增加。结论G-CSF可通过激活NF-κB信号通路上调mi R-146a表达,从而降低HL-60表面的CXCR4表达而阻断CXCR4/SDF-1α信号轴,最终打破基质细胞对HL-60的保护作用而使其对化疗药物更加敏感。
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