白藜芦醇干预缺血后处理对H9c2(2-1)心肌细胞坏死率及p38MAPK/PPARγ途径的研究

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目的:将具有天然心血管保护作用的PPARy (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)激活剂——白藜芦醇(Resveratrol, RSV)与减轻再灌损伤的有效手段——缺血后处理(Ischemic Postconditioning, IPO)联合作用于受损心肌细胞,观察联合后的保护效果,并通过对应激保护途径关键酶p38 MAPK变化、p38 MAPK下游分子PPARy变化、PPARy下游分子AP-1变化的测定,探讨RSV联合IPO的作用机制。验证假设:RSV可以通过改善p38 MAPK信号通路增加PPARy表达,降低AP-1表达来增强IPO对再灌损伤心肌细胞的保护作用。方法:购得H9c2(2-1)细胞株并于含10%FBS的DMEM中培养,待细胞生长为80%时:细胞分为对照组(C组)、I/R组、RSV+I/R组、IPO组、RSV+IPO组。C组:不处理;I/R组:模拟缺血培养基和复血培养基进行I/R; RSV+I/R组:RSV干预20min后给予I/R; IPO组:模拟缺血培养基和复血培养基进行IPO; RSV+IPO组:RSV干预20min后给予IPO。1. IPO实验IPO干预细胞后Oh、12h、24h分别利用AO-EB法测定细胞平均坏死率,分别观察RSV单独和联合IPO时减轻心肌细胞I/R损伤的作用。2. RSV联合IPO对p38 MAPK/PPARy/AP-1通路影响IPO后12h,利用Western blotting技术检测p38 MAPK蛋白表达、磷酸化情况,PPARγ、AP-1蛋白表达情况。采用半定量RT-PCR技术检测p38 MAPK、cyclinA2 mRNA表达情况。观察RSV干预后再进行IPO时MAPK信号转导途径的变化。3. p38 MAPK抑制剂对保护作用及上述通路的影响在以上五组基础上增加RSV+SB+IPO组。RSV+SB+IPO组:给予p38 MAPK抑制剂SB203580 20min, RSV20min,给予IPO。IPO后12h,利用AO-EB法测定细胞平均坏死率,Western blotting技术检测PPARγ、AP-1蛋白表达情况。采用半定量RT-PCR技术检测cyclinA2 mRNA表达情况。观察抑制p38 MAPK对RSV联合IPO的保护作用的影响,以及下游分子PPARγ、AP-1蛋白表达变化。结果:1. RSV单独和联合IPO时均可减轻心肌细胞I/R损伤用IPO干预H9c2(2-1)细胞0h、12h、24h后,各时间点IPO组细胞平均坏死率均低于I/R组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。0h到12h呈增加趋势,12h到24h趋于平稳,并稍有降低。IPO组和RSV组细胞平均坏死率均低于I/R组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。RSV+IPO组细胞平均坏死率分别低于IPO和RSV单独作用,差异有显著统计学意义(P<0.05)。2 RSV联合IPO对p38 MAPK/PPARy/AP-1通路影响p38 MAPK蛋白水平:IPO后0h,IPO组高于I/R组。12h时,IPO组低于I/R组,24h时进一步降低,RSV+IPO组低于I/R组和C组,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。p38 MAPKmRNA变化与p38 MAPK蛋白水平变化趋势一致。12h时p38 MAPK磷酸化水平:IPO组低于I/R组,RSV+IPO组低于IPO组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。PPARy蛋白水平:I/R组与C组无差异,IPO组高于I/R组,RSV+IPO组高于IPO组,差异有显著统计学意义(P<0.05);AP-1蛋白水平:I/R组低于C组,IPO组低于I/R组,RSV+IPO组低于IPO组,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。12h时cyclinA2 mRNA:IPO组高于I/R组和C组,RSV+IPO组高于IPO组,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。3 p38 MAPK抑制剂对保护作用及上述通路的影响细胞平均坏死率:SB+RSV+IPO组高于RSV+IPO组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。PPARy蛋白水平:SB+RSV+IPO组低于RSV+IPO组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。AP-1蛋白水平:SB+RSV+IPO组高于RSV+IPO组,差异有显著统计学意义(P<0.05).cyclinA2 mRNA:SB+RSV+IPO组与RSV+IPO组无统计学差异。cyclinA2蛋白:SB+RSV+IPO组低于RSV+IPO组。结论:1、IPO后0-24h, RSV单独和联合IPO时均可减轻心肌细胞细胞平均坏死率,联合IPO时可促进IPO对心肌细胞的保护作用。2、与IPO比较:RSV联合IPO可降低p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK和AP-1表达,升高PPARy及cyclinA2表达。RSV通过改善p38 MAPK信号通路,促进了IPO对心肌细胞的保护作用。3、p38MAPK抑制剂减弱了RSV联合IPO对细胞平均坏死率、PPARy和AP-1蛋白水平、cyclinA2表达的影响,保护作用降低。提示在RSV联合IPO过程中,p38MAPK作为PPARγ、AP-1的上游分子起重要作用。
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