【摘 要】
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谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）是公认安全（Generally recognized as safe,GRAS）的生产菌株,具有培养条件不复杂、生长速度较快的特点。谷氨酸棒状杆菌全基因组数据的解析、遗传操作系统的成熟和对其蛋白质分泌机制的理解,为将其开发成生产重组蛋白的通用细胞工厂奠定了基础。为了使谷氨酸棒杆菌更高效的生产重组蛋白,需要开发具有优良性能的“基因表达
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谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）是公认安全（Generally recognized as safe,GRAS）的生产菌株,具有培养条件不复杂、生长速度较快的特点。谷氨酸棒状杆菌全基因组数据的解析、遗传操作系统的成熟和对其蛋白质分泌机制的理解,为将其开发成生产重组蛋白的通用细胞工厂奠定了基础。为了使谷氨酸棒杆菌更高效的生产重组蛋白,需要开发具有优良性能的“基因表达工具盒”,其包括:宿主、载体、启动子、分泌途径、信号肽以及其他一些与基因表达相关的元件。本文主要研究的是“基因表达工具盒”中的信号肽。信号肽是转运蛋白前体N-末端的一小段肽段,其决定着转运蛋白的跨膜运送途径,而最终被细胞膜上的信号肽酶SPaseI切割并不出现在成熟的蛋白质中。信号肽的强弱决定着蛋白分泌效率。本论文主要研究成果如下:（1）构建了载体pAU19。设计并合成带有tacM强启动子、C.glutamicum RBS—致序列和多克隆位点的信号肽探测载体克隆/表达盒,与实验室前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pAU2连接,构建载体pAU19。（2）构建了信号肽探测载体pAU20。以枯草芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶AprE为报告蛋白,将其编码基因连接到载体pAU19克隆/表达盒的多克隆位点处,构建谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体pAU20。（3）构建了重组信号肽探测载体。分别对枯草芽孢杆菌的bglS、amyE、Vpr、yvgO、yckD、yobB、yndA,地衣芽孢杆菌的 BprA、epr、ywaD、PbpB、oppA、ydhT 以及谷氨酸棒杆菌的cgr2063、cgr2070、cgr2495共16种Sec型信号肽编码序列进行PCR扩增。把上述16中信号肽片段与信号肽探测载体pAU20连接,转入大肠杆菌中,酶切和测序验证,获得重组信号肽探测载体。（4）将重组信号肽探测载体转入谷氨酸棒状杆菌中,获得谷氨酸棒杆菌探测载体工程菌株。（5）工程菌株摇瓶发酵培养物上清液碱性丝氨酸蛋白酶酶活测定结果表明,信号肽Vpr和BprA活性显著强于谷氨酸棒杆菌内源强信号肽cgr2070,oppA、Epr、cgr2063和ywaD活性稍弱于cgr2070,但高于谷氨酸棒杆菌中其他信号肽的活性,因此以上这些信号肽都属于谷氨酸棒杆菌强信号肽。
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