研究目的肿瘤的异质性是恶性肿瘤的一个特征性表现。在原发肿瘤细胞中存在着不同的肿瘤细胞亚群,这些亚群具有不同的形态、不同的增殖能力、不同的表型和染色体组型的特征。我们在肝细胞癌病理诊断中发现,在一个肝细胞癌肿瘤内存在着不同的病理组织学类型表现,我们将这类肝细胞癌的特殊亚型首次命名为多组织学结构肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma with multi-histological structures,MS-HCC),对于MS-HCC的临床病理学特征及其内在的分子病理学特征,我们将在本次研究中开展,本研究的研究目的是:⑴建立MS-HCC的诊断标准,采用基因组微卫星(Microsatellite)实验的杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)分析策略,探讨MS-HCC的分子克隆起源特点,为了解MS-HCC不同区域肿瘤细胞的分子分型提供分子病理学依据;⑵通过对MS-HCC的克隆起源分子分型,收集MS-HCC的临床与病理学资料,通过统计分析,探讨其临床和病理学特点。⑶采用全外显子捕获测序(whole exome sequencing,WES)分析策略,筛选MS-HCC多克隆起源(multi-clonal origin,MO)和单克隆起源(single clonal origin,SO)两种分型的驱动基因谱的构成,通过生物信息学的方法预测其作用的靶基因,进而为开展MS-HCC靶基因功能通路的研究提供新的思路;研究方法⑴选取2010年1月~2014年12月期间,在第二军医大学东方肝胆外科医院行手术切除且临床资料完整的41例MS-HCC患者,MS-HCC在显微镜下的不同区域组织形态学分型参照HCC的WHO标准。MS-HCC的诊断标准为:(1)在同一个HCC肿块内出现2种或2种以上的组织学结构,如细梁型、粗梁型、假腺管型、透明细胞型和团片型等不同组织学结构组合存在,或在同一个HCC肿块内出现2种或2种以上不同分化程度的癌细胞,如Edmondson分化Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级等不同癌细胞成分组合存在。(2)上述不同HCC组织学结构或细胞学成分中的一种应占肿瘤总面积的15%以上,且各肿瘤成分相邻分布,分界清楚。根据上述MS-HCC诊断标准,我们将MS-HCC分别进行分类:(1)组织多样型;(2)分化多样型。⑵根据我科实验室建立的多结节性肝细胞癌和复发性肝细胞癌克隆起源特征微卫星LOH检测技术流程,选择10个在肝脏基因组中的微卫星高频LOH位点。以手术切除的41例MS-HCC为微卫星实验研究对象,通过显微切割技术分别获取MS-HCC的两种区域组织,经DNA抽提和微卫星PCR-SSCP方法检测,按照文献共识,分别以微卫星发生LOH差异位点的比例<30%和≥30%作为肿瘤单克隆(SO)和多克隆(MO)起源模式的诊断标准,分析不同组织学类型MS-HCC在各微卫星LOH位点的分布和发生频率上的差异特点,对MS-HCC进行分子克隆分型;⑶收集完整的41例MS-HCC患者临床与病理学资料,患者的性别、年龄、临床症状等临床参数来源于原始病历记录;分析不同克隆起源分型下的MS-HCC的临床病理学特点及各项参数的相关性。⑷从上述MS-HCC样本中选取5例克隆分型为MO型的MS-HCC样本进行WES实验,采用Illumina HiSeq 2500测序平台进行驱动基因的筛选。每例MS-HCC分别用肿瘤旁肝组织、区域1、区域2进行WES实验,筛选出区域1与区域2突变不同且在肿瘤旁肝组织无突变表达的驱动基因,采用靶基因预测数据库进行作用靶基因的筛选。研究结果⑴41例MS-HCC中,出现的组织学类型可以有假腺管型、细梁型、富脂型、花环状细胞型、菊形团状细胞型、团片型、透明细胞型、硬化型,我们代称为X型,在37例(90.2%)组织多样型MS-HCC中,两种区域共计13种组合,即粗梁型+X型,共7种组合;细梁型+X型,共4种组合;团片型+X型,共2种组合;分化多样型共4例(9.8%),共有3种组合,即细梁型结构:分化差区域+分化好区域,共2例;粗梁型结构:分化差区域+分化好区域,共1例;团片型结构:分化差区域+分化好区域,共1例。⑵微卫星位点检测结果显示:41例进行微卫星克隆分型的MS-HCC病例中,克隆分型以单克隆起源(SO)为主,占58.5%,多克隆型(MO)MS-HCC占41.5%。在所检测的微卫星位点中,10个微卫星位点(LOH+MSI)差异频率从6.2%到36.1%,D17S938(36.1%)和D16S514(32.4%)是判定MS-HCC克隆分型时的微卫星高频位点。D17S938为微卫星不稳定性的高频位点,D16S514为微卫星杂合性缺失的高频位点。⑶临床病理学特点分析显示:本组男性发病比例明显多于女性,中位数年龄为53岁,有肝炎病史的患者占87.8%,患者术后复发占65.9%,复发间期为0.5个月-9年,平均复发间期=7.8个月,呈现高复发及短期复发趋势。血清学生化检查显示,乙肝表面抗原(HBsAg)和甲胎蛋白(AFP)升高多见。肿瘤TNM分期,I-II期占87.8%,Ⅲ-Ⅳ期仅占12.2%。病理学指标显示:MS-HCC肿瘤平均直径为4.6±3.8cm,多为小肝癌,多为孤立肿瘤内形成的两个组织形态学不同区域(70.7%),多发肿瘤占29.3%,其中有4例为主瘤旁卫星灶,直径0.2~1.1cm,肿瘤有包膜占75.6%,53.7%的患者出现肝硬化,出现血管侵犯或形成血管癌栓者仅占24.4%,差异不大。比较肿瘤结节内各区域肿瘤细胞分化程度时,各区域间分化程度相同者占61%,分化程度不同者占39%。⑷已克隆分型的41例MS-HCC单克隆起源(SO)组为24例,多克隆起源(MO)组为17例,通过临床病理指标的X2检验或者Fisher’s精确概率统计学分析,结果显示,克隆起源模式的不同与患者的性别、年龄、肝炎病史等各项临床指标及肿瘤大小、TNM分期等病理学指标无显著相关性,但是与MS-HCC肿瘤内各自区域的分化异同显著相关(P<0.01);MO组患者的甲胎蛋白(AFP)阳性比例显著升高(64.7%),SO组患者的AFP值差异不大;MO组患者肝硬化(70.6%)明显高于SO组患者。⑸通过对5例MO型MS-HCC的WES原始数据的数据质控、基因组比对、捕获富集分析、SNV和In Del分析及注释、SNV及indel数据筛选,建立目的基因组DNA测序文库,共筛选出102个突变基因,115个基因突变位点,这些基因多分布在11、7、1、17、2、5、19、3号染色体上。结论⑴率先提出MS-HCC这一特殊病理现象的概念及病理诊断标准,并对其进行分子病理分型研究,既是对肿瘤异质性的基础性探讨,也是对HCC诊断病理的亚型细分,并可能成为对HCC异质性的分子分型和精细化分子病理学诊断的切入点。⑵对MS-HCC进行分子分型,组织发生以单克隆起源(SO)为主,有理由推测,SO型MS-HCC的组织学结构和细胞学分化虽然出现多样化,但仍以优势干系为主体的单克隆细胞群体为主。HCC高频微卫星位点中的D17S938和D16S514发生微卫星变异频率最高,有可能作为鉴别MO型和SO型MS-HCC的分子病理学标志物。⑶MS-HCC作为HCC的一类特殊亚型,仍多发于男性,以50岁左右为主要发病人群,乙肝表面抗原(HBsAg)和甲胎蛋白(AFP)升高多见,在肝切除手术后,患者呈现高复发及短期复发,MO型患者肝硬化明显高于SO型患者,且MS-HCC肿瘤各区域细胞的分化异同与克隆分型显著相关,提示MO型MS-HCC的细胞群体由于由多个干系的细胞群体混合构成,生物学行为和对治疗模式的敏感性呈现复杂化和多样化趋势,因而恶性程度明显增加。(4)用全外显子测序的方法可以了解MS-HCC的基因组差异特征,提示MS-HCC在细胞克隆进化时会出现基因突变,为后续进一步验证筛选驱动基因及开展MS-HCC分子机制研究提供基础。