目的:人类诺如病毒(Human norovirus,Hu NV)是造成急性肠胃炎的主要病因之一,已经在多个国家爆发流行,给公共卫生事业带来了巨大的经济负担。诺如病毒的检测及流行病学研究对于疫苗研究及疾病的防控具有重要意义,然而云南省目前在该方面的研究还较为欠缺,因此本研究对2018年10月至2019年2月期间昆明诺如病毒爆发流行的基因型别进行分型,对该病毒感染阳性患儿的相关临床症状与感染的基因型进行统计学分析。其次通过建立可靠的、敏感的、标准化的实验室NV GⅡ病毒检测方法,为临床NV感染的诊断、治疗以及疫苗的研究提供技术手段。最后对流行较广的GⅡ.4病毒株的全基因序列进行分析,可以提供病毒基因组信息的遗传特征、潜在来源和进化,有助于疾病预防和疫苗研究。方法:(1)2018年10月至2019年2月在昆明市儿童医院收集临床诊断为病毒性腹泻的0-10岁住院部患儿的粪便样品80份和门诊患儿的粪便样品157份,共计237份,其中男145例,女92例,男女性别比为1.6:1。采用通用引物进行常规RT-PCR检测,样品的PCR产物送往昆明硕擎生物科技公司进行纯化测序,测序结果在BLAST上比对,统计比对结果,并且记录相应临床症状。(2)构建NV GⅡ标准质粒是将合成的高度保守NV GⅡ基因序列片段500bp克隆至p UC57载体上,采用常规PCR进行验证。Ct值与病毒拷贝数的标准曲线是通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制,求得其相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及其检测体系对在第一章获得的84份NV阳性样品中选取4份临床粪便样品进行检测。(3)在第一章中已经确诊为GⅡ组NV感染阳性粪便中选取6份样品。根据在NCBI数据库中下载NV GⅡ株的全基因序列设计了8对用于全基因检测的特异性引物,通过常规PCR反应、并且将样品PCR产物送往昆明硕擎生物科技公司进行纯化测序,将测序结果在BLAST上比对,测序成功的序列片段进行拼接,最后将拼接好的全基因序列上传基因库,对拼接成功的全基因序列进行遗传特征、潜在来源和进化分析。结果:(1)样品检测结果显示:237例粪便样本中,共检出NV感染阳性样品84份,其检出率为35.44%。GI组NV包含1种基因型,GⅡ组NV包含11种基因型。数据显示基因型GⅡ.4仍然为优势流行株,重组基因型GⅡ.Pe-GⅡ.4和基因型GⅡ.3感染率出现增高的趋势。NV感染率最高的年龄范围是为12-23月的儿童,其感染率为45.71%(32/70),统计分析发现NV感染阳性与临床特征表现为发热、呕吐、每天腹泻次数大于3次,腹泻粪便为水样或蛋花样现象有显著相关性。对NV感染阳性患儿男女比率进行统计学分析,则显示NV感染阳性与男女性别无统计学意义。(2)经PCR验证,成功构建了GⅡ组诺如病毒标准质粒。通过标准品的实时荧光定量PCR获得相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R~2=0.9907,根据标准曲线方程换算出4份粪便样品原液的病毒拷贝数分别为30443.45、9468.40、53176.69、4493.12 copies/μL。(3)通过GⅡ引物成功测序了2个样品的全基因序列。GⅡ.4的基因组总长度为7545个核苷酸,由5100个核苷酸的ORF1、1623个核苷酸的ORF2和807个核苷酸的ORF3组成。对ORF1,ORF2,ORF3三部分进行系统发育树分析结果显示三个部分都与基因型为GⅡ.4的2017年中国济南株(MG214988)在同一分支上,相似度最高。结论:(1)儿童NV感染的主要基因组GⅡ,优势流行株为GⅡ.4,其次GⅡ.3与重组基因型GⅡ.Pe-GⅡ.4感染率仅次于优势流行株。(2)NV感染阳性的高风险人群是2岁以下的幼儿。(3)NV感染阳性与儿童临床特征表现为发热、呕吐、每天腹泻次数大于3次,腹泻粪便为水样或蛋花样症状有相关性。(4)NV感染阳性与男女性别无统计学意义。(5)成功使用实时荧光定量PCR建立了粪便样品中GⅡ组诺如病毒检测的方法。(6)通过GⅡ全基因引物成功测序了2个样品的全基因序列。(7)对ORF1,ORF2,ORF3三部分进行系统发育树分析结果显示三个部分都与基因型为GⅡ.4的2017年中国济南株(MG214988)在同一分支上,相似度最高。