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目的: 考察鸡血藤和苏木两种中药醇洗脱部位的抗氧化以及抗炎作用,并考察D-半乳糖模型致大鼠血管氧化损伤及其两种中药醇洗脱部位的保护作用。 方法: 1.两种中药醇洗脱部位的制备 将鸡血藤和苏木两种中药饮片用70%乙醇提取3次,每次2小时,然后用D-101大孔树脂湿法上样,分别用蒸馏水、10%、30%、50%、70%乙醇洗脱,我们中心先期实践证明鸡血藤50%醇洗脱部位和苏木70%醇洗脱部位具有最显著血管内皮依赖的血管舒张作用和抗炎作用,本论文采用这两种中药有效部位进行相关实验。 2.两种中药醇洗脱部位体外抗氧化作用的研究 我们选取大鼠红细胞膜作为材料,以Xan-Xo、H2O2、UV照射3种自由基生成体系诱导红细胞膜氧化应激模型,并通过测量MDA含量、以及T-SOD、GSH-PX的活性来考察两种中药醇洗脱部位的体外抗氧化作用。 3.两种中药醇洗脱部位对D-半乳糖致大鼠血管损伤模型的抗氧化和保护研究 将SD(雄性、200g左右)大鼠腹腔注射D-半乳糖8周,制备大鼠氧化应激模型,40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、鸡血藤50%醇洗脱部位(JXT)组、苏木70%醇洗脱部位(SM)组以及Vc组,每组动物8只。实验后麻醉大鼠,并采取胸主动脉以及颈动脉、股动脉等大动脉。①采用Power Lab血管功能评价系统,考察D-半乳糖致氧化应激引起的胸主动脉血管张力变化,来评价D-半乳糖对大鼠胸主动脉的氧化损伤以及中药醇洗脱部位是否改善胸主动脉的张力来考察其的保护作用;②通过检测试剂盒测量动脉组织中氧化应激相关指标MDA含量、T-SOD、GSH-PX的活性,来评价动脉组织的氧化应激以及两种中药醇洗脱部位是否对血管氧化损伤具有保护作用;③运用全自动生化分析仪检测血清中的TC、TG、LDL、HDL的含量和ELISA检测CRP、Apo A1、Apo B含量,来评价动脉血管硬化相关指标以及炎症变化等病理指标来考察两种中药醇洗脱部位是否对改善血管硬化相关指标、炎症变化病理指标有效。 4.两种中药醇洗脱部位对大鼠血管氧化损伤保护作用的机制探索 4.1 RT-PCR实验检测两种中药醇洗脱部位对相关基因表达的影响 采用RT-PCR实验,从基因水平考察两种中药醇洗脱部位对炎症相关基因IL-1β、iNOS、ICAM-1、VCAM-1和内皮功能相关基因eNOS的表达情况。通过测定这些细胞因子的基因水平来推断两种中药醇洗脱部位对D-半乳糖致大鼠血管氧化损伤的影响。 4.2 Western-Blot检测两种中药醇洗脱部位对相关蛋白的表达的影响 采用Western-Blot法,从蛋白水平进一步8考察两种中药醇洗脱部位对炎症相关蛋白IL-1β、iNOS、TNF-α以及内皮功能相关蛋白eNOS的表达情况,并且从NF-κB信号通路中的相关蛋白IκBα,P-Iκ Bα来考察其对血管氧化损伤的保护作用。 结果: 1.通过体外抗氧化实验,鸡血藤醇洗脱部位(2.5 mg/mL)和苏木醇洗脱部位(1mg/mL)能够显著抑制MDA的产生,鸡血藤醇洗脱部位(5mg/mL)和苏木醇洗脱部位(2 mg/mL)明显升高T-SOD活性、鸡血藤醇洗脱部位(5 mg/mL)和苏木醇洗脱部位(1 mg/mL)明显升高GSH-PX的活性。提示这两种中药醇洗脱部位能够通过阻断自由基生成或者直接清除自由基来减轻氧化应激造成的损伤。 2.通过体内实验,SD大鼠腹腔注射D-半乳糖8周后,①模型组大鼠胸主动脉由D-半乳糖致氧化应激引起的舒张度显著下降,提示大鼠动脉血管出现的氧化及炎症损伤导致内皮依赖的血管舒张功能发生紊乱,可能与eNOS表达下降和脱偶联有关,鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位均能够显著的提高胸主动脉的舒张度,改善内皮功能;②模型组动脉组织中MDA生成明显增多、T-SOD、GSH-PX活性显著下降,提示大鼠动脉组织出现氧化应激,鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位能够显著抑制MDA生成,提高T-SOD、GSH-PX活性,抗氧化作用明显;③模型组大鼠血清中TC、TG、LDL、CRP、Apo B含量显著升高以及Apo B/ApoA1比值升高,HDL、ApoA1含量明显降低,提示模型组大鼠出现动脉硬化相关指标的变化,CRP显著升高提示存在炎症相关病理变化,鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位均能够显著降低血清中TC、TG、LDL、CRP、Apo B含量以及降低Apo B/Apo A1比值,显著升高HDL、Apo A1含量,说明鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位能够改善血管的损伤程度,起到保护作用。而Vc对改善胸主动脉的张力变化、降低血清中TC、TG、LDL、CRP、Apo B含量以及Apo B/ApoA1比值,升高HDL、ApoA1含量没有统计意义,但是能够显著抑制MDA生成,明显提高动脉组织中的T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性,在体内具有抗氧化作用。 3.1 通过RT-PCR实验,模型组大鼠动脉组织的IL-1β、iNOS、ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达显著升高,eNOS mRNA的表达显著下降。鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位均可以明显地降低IL-1β、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达,但是只有鸡血藤醇洗脱部位能够显著升高eNOS mRNA的表达,而维生素C对动脉组织中的IL-1β、iNOS、ICAM-1、VCAM-1和eNOS mRNA的表达没有显著变化。 3.2 通过Western-Blot实验,模型组大鼠动脉组织的IL-1β、iNOS、TNF-α的蛋白表达显著升高,eNOS的蛋白表达显著下降,鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位均可以明显地降低IL-1β、iNOS、TNF-α的蛋白水平,但是只有鸡血藤醇洗脱部位能够显著升高eNOS的蛋白水平。通过检测IκBα,P-Iκ Bα的蛋白水平,发现模型组大鼠动脉组织的P-Iκ Bα/IκBα比值明显降低,鸡血藤醇洗脱部位和苏木醇洗脱部位可以明显升高P-IκBα/IκBα的水平,而维生素C对IL-1β、iNOS、TNF-α和eNOS的蛋白表达没有显著变化,而且对P-IκBα/IκBα的水平也没有明显影响。 结论: 1.红细胞膜在Xan-Xo、H2O2、UV照射三种自由基生成体系的攻击下,引起脂质过氧化反应,生成过氧化脂质,造成氧化应激,MDA的生成增多,T-SOD、GSH-PX的活性下降。通过检测MDA含量,以及T-SOD、GSH-PX的活性可以很好的评价药物的抗氧化作用。 2.SD大鼠腹腔注射D-半乳糖后产生的大量AGE和ROS造成氧化应激,引起组织和细胞损伤,并激活NF-κB信号通路引起炎症反应,使血管出现氧化损伤,血管硬化、舒张度降低、内皮功能紊乱等一系列反应。D-半乳糖氧化应激模型导致血管损伤可以很好的用于评价药物的体内抗氧化、抗炎以及内皮保护作用。 3.鸡血藤50%醇洗脱部位在体外具有较好的抗氧化作用,能够显著的抑制MDA生成,提升T-SOD、GSH-PX活性;在体内能够较好改善内皮功能,提高胸主动脉舒张度,抑制MDA生成,提升T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性;降低炎症因子IL-1β、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平,提升eNOS mRNA的水平;抑制炎症相关蛋白IL-1β、iNOS、TNF-α的表达,促进eNOS蛋白表达,而且阻止IκB磷酸化,抑制NF-κB信号通路的激活,具有较好的抗氧化抗炎作用。鸡血藤醇洗脱部位具有较好的抗氧化抗炎作用,能够较好的减轻氧化应激及炎症对机体的损伤,而且具有内皮保护功能。 4.维生素C虽然在体内体外都能够抑制MDA生成,提升T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性,抗氧化作用明显,但是却没有显示抗炎作用。 5.苏木醇洗脱部位在体外能够抑制MDA生成,提升T-SOD、GSH-PX活性;在体内同样可以抑制MDA生成,提升T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性;降低炎症因子IL-1β、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA的水平;抑制炎症相关蛋白IL-1β、iNOS、TNF-α的表达,阻止IκB磷酸化,抑制NF-κB信号通路的激活,抗氧化抗炎作用明显。