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强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是常见的炎症性系统性风湿病,其发病率及致残率均较高,但至今其病因及发病机制研究尚未完全阐明,早期诊断尚存在较大困难,目前亦无理想的根治方法。因此,对AS的病因、发病机制、诊断指标、治疗靶点和治疗相关药物的进一步研究,以加强对AS疾病的了解和认识,使AS患者在疾病早期能得到正确的诊断和有效治疗,对于改善AS患者预后、提高国民健康素质均有重要意义。蛋白质组学研究具有高通量、高灵敏度和高精确度等优点,有关AS患者蛋白质组差异表达情况至今尚罕有报道,本研究拟探讨AS患者蛋白质组差异表达情况,为以后AS的发病机制、早期诊断和治疗提供理论依据和重要的研究线索。
第一部分
强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞的蛋白质组学研究
目的:
应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术寻找并鉴定AS患者、RA患者与健康志愿者(Healthy Volunteer,HV)之间外周血单个核细胞(PBMCs)的差异表达蛋白,再挑选部分在AS中有显著差异表达的蛋白采用Western-blot和/或实时荧光定量RT-PCR方法扩大样本量进行验证,寻找AS的疾病相关蛋白,为AS的发病机制、诊断、鉴别诊断以及治疗提供新的理论依据和研究线索。
材料与方法:
1.分别收集年龄与性别相互匹配的AS患者、HV和RA患者EDTA抗凝血各6例。分离PBMCs并提取总蛋白后分别进行双向凝胶电泳。凝胶图谱经PDQuest软件分析后找出组间表达差异至少达5倍的蛋白质点行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)或MALDI-TOF-TOF-MS分析获得肽质量指纹图谱(PMF)或肽序列标签(PST),然后利用Mascot搜索引擎搜索Swiss-Prot数据库鉴定蛋白质。
2.将研究样本扩大到每组32例,从鉴定出的在AS患者有显著差异表达的蛋白中挑选Talin1和Integrin-Iinked kinase以Western-blot方法进行验证,并进一步采用实时荧光定量RT-PCR对Talin1 mRNA进行检测,以验证双向电泳发现的差异蛋白质表达结果。
结果:
1.成功建立了重复性好、分辨率高的PBMCs蛋白质组双向凝胶电泳图谱。软件分析后得到10个在AS组中高表达的差异蛋白质点,经质谱分析成功鉴定出6个蛋白,分别为丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK)、肌动蛋白抑制蛋白1(Profilin1,PFN1)、踝蛋白1(Talin1,TLNl)、亲环素A(Cyclophilin A,CYPA)A链、未知蛋白(gi|16306948)和整合素连接激酶(Integrin-IinkedKinase,ILK)。
2.Western-blot结果提示,经内参校正后的TLN1在AS、HV及RA组分别为1.1411±0.4292、0.4686±0.2139和0.3805±0.1590,而ILK则分别为1.1201±0.2705、0.7404±0.2310和0.7011±0.3794,TLN1及ILK在AS组的平均表达水平均明显高于HV和RA组(P<0.05); RA组患者TLN及ILK的平均表达水平较HV组稍低,但两组间的差异并无显著性(P>0.05)。
3.实时荧光定量RT-PCR结果显示,AS、HV及RA组TLN1 mRNA的水平分别为9.36±2.20、1.00±0.24和0.97±0.20,AS组明显高于HV及RA组(P<0.05),而RA组患者TLN1 mRNA水平与HV组相近(P>0.05)。
结论:
1.双向凝胶电泳结合质谱技术可成功建立PBMCs差异蛋白质组学研究方法,为寻找疾病相关蛋白质和疾病标志物的研究提供了有效手段。
2.AS患者、健康志愿者和RA患者PBMCs蛋白表达谱间存在差异,PK、PFN1、TLN1、CYPAA链、ILK在AS患者中存在明显而特异的表达增高。
3.PK、PFN1、TLN1、CYPA A链及ILK可能为AS的疾病相关蛋白,可作为AS潜在的疾病标志物行进一步研究,为AS的发病机制和血液学诊断指标的研究提供了重要线索。
第二部分
强直性脊柱炎患者血清蛋白质组学研究
目的:
应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术寻找并鉴定AS患者、RA患者与健康志愿者(Healthy Volunteer,HV)血清之间的差异表达蛋白,并挑选部分差异蛋白采用ELISA方法扩大样本量进行验证,寻找AS患者血清中的疾病相关蛋白,为AS的发病机制、诊断、鉴别诊断以及治疗提供新的理论依据和研究线索。
材料与方法:
1.分别收集年龄与性别相互匹配的AS患者、HV和RA患者血清各6例。采用混合上样方法,经去除高峰度蛋白后分别进行双向凝胶电泳。凝胶图谱经PDQuest软件分析后找出组间表达差异至少达5倍的蛋白质点行MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS分析获得PMF或PST,然后利用Mascot搜索引擎搜索Swiss-Prot数据库鉴定蛋白质。
2.将研究样本扩大到每组32例,从鉴定的差异蛋白中挑选CP protein和transthyretin经ELISA进行检测,以验证双向电泳发现的差异蛋白表达结果。
结果:
1.成功建立了重复性好、分辨率高的血清蛋白质组双向凝胶电泳图谱。软件分析后得到13个在AS和/或RA组中存在异常表达的差异蛋白质点,经质谱分析鉴定出10个蛋白,其中plasma glutathione peroxidase(GPx3)和similar tocomplement component3仅在AS组中表达降低,transthyretin(TTR)A链在AS及RA组表达均明显下调,amyloid related serum protein SAA(SAA)、apolipoprotein A(ApoA)-IV、ApoA-IV precursor、haptoglobin Hp2(Hp2)、CP protein和IGSF22 protein在AS及RA组表达均升高,而HT016仅在RA组表达增高。
2.经ELISA检测,CP在AS、HV及RA组分别为0.2963±0.0650、0.2035±0.0374和0.3295±0.1125 mg/ml,AS及RA组较HV组明显升高(P<0.05),而AS与RA组间差异无显著性(P>0.05);TTR在AS、HV及RA组分别为0.0993±0.0197、0.1544±0.0431和0.1077±0.0219 mg/ml,AS与RA组较HV组有明显降低(P<0.05),而AS与RA组间差异无显著性(P>0.05)。
结论:
1.经有效去除高丰度蛋白后,利用双向凝胶电泳结合质谱技术可成功建立血清差异蛋白质组学研究方法,为寻找疾病相关蛋白和疾病标志物的研究提供了有效手段。
2.AS患者、健康志愿者和RA患者血清蛋白表达谱间存在差异,GPx3和similar tocomplement component3在AS患者中存在特异的表达降低,而HT016仅在RA组高表达,因而这3个蛋白有可能为AS或RA潜在的血清疾病标志物,经进一步验证后作为AS和RA早期诊断和鉴别诊断指标,也有可能作为AS或RA特异性药物治疗的研究靶点。
3.TTR在AS与RA患者中表达均下降而SAA、ApoA-IV、ApoA-IV precursor、Hp2、CP protein及IGSF22 protein在AS与RA患者中表达均升高,这些蛋白可能为AS和RA的疾病相关蛋白,为AS和RA发病机制的研究提供了重要线索。