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本研究通过筛选西农萨能奶山羊泌乳中期和泌乳后期的差异表达基因并对差异基因进行克隆和功能研究,为奶山羊乳腺中脂肪和蛋白质代谢分子机理研究等提供理论依据。本研究主要包括以下内容:(1)利用抑制消减杂交技术寻找山羊泌乳中期与后期乳腺组织差异表达基因,结合实时定量PCR方法分析差异表达基因mRNA在不同泌乳阶段的相对含量;(2)利用RT-PCR及RACE技术克隆gBTN1A1基因的cDNA序列,并分析信号肽序列、跨膜结构、二级结构及三级结构;(3)利用实时定量PCR技术对gBTN1A1基因在整个泌乳期(初期、盛期、中期、后期和末期)的表达量进行分析,研究其在MCF-7细胞中的定位;(4)构建gBTN1A1基因的原核表达载体,摸索最适的原核表达条件,利用Western-blot技术检测重组蛋白的表达;(5)构建真核表达载体,转染MCF-7细胞,检测细胞内脂肪酸组分的变化,研究gBTN1A1基因对脂肪酸代谢的影响,检测其对细胞生长的影响;(6)克隆gBTN1A1基因的启动子序列,构建CAT表达载体,并检测启动子的活性,观察催乳素对山羊嗜乳脂蛋白基因启动子活性的影响,利用生物信息学方法分析gBTN1A1基因启动子序列与牛、人及小鼠BTN1A1基因启动子序列的同源性及转录因子结合位点。主要研究结果如下:(1)通过抑制消减杂交试验成功构建M-L(中期Vs后期)和L-M(后期Vs中期)消减文库,消减效率分别为25和210。部分序列测序后发现在M-L文库中的差异表达基因主要包括3类:乳脂肪形成相关基因(BTN1A1、XDH和AFABP);乳蛋白相关基因(αS2酪蛋白、β酪蛋白、κ酪蛋白和α乳清蛋白)和转录复合体相关基因(核糖体蛋白S27a、核糖体蛋白S12)。L-M文库中的差异表达基因主要包括6类:凋亡相关基因(Ubi-d4、FeHc、血管钙化上调基因、基质细胞延伸因子4);脂类代谢相关基因(SCD、SAA3);抗氧化相关基因(MGST);转录起始相关基因(核糖体蛋白L17和核糖体蛋白L35a);能量代谢相关基因(泛醇细胞色素C还原酶为呼吸链组分);细胞骨架形成相关基因(平滑肌肌球蛋白重链)。(2)成功克隆gBTN1A1基因,全基因包括7个外显子和6个内含子,开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸残基,前26个氨基酸为推定的信号肽序列。gBTN1A1基因cDNA序列与牛、人和小鼠的同源性分别为95%、53%和35%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。通过跨膜结构预测,gBTN1A1属于单跨膜蛋白,跨膜区域位于243-269肽段。gBTN1A1二级结构主要由不规则螺旋、α-螺旋和延伸链组成,主要包括三个功能结构域:IgV、IgC和B30.2。gBTN1A1基因的结构与牛、人及小鼠的相似,推测该基因主要的功能是调控乳脂肪球的分泌。(3)通过分析gBTN1A1基因在整个泌乳期表达水平的变化,发现其从泌乳初期到盛期表达量的增长幅度较大,且在盛期达到最大,从盛期到中期,表达量相对恒定,然后开始缓慢下降,从而进一步证实gBTN1A1基因表达与乳脂肪球分泌之间的相互关系。gBTN1A1基因在泌乳初期的表达量是末期的4.09倍,说明gBTN1A1基因的表达始于妊娠后期,整个泌乳期的变化趋势与泌乳曲线一致,说明gBTN1A1基因可能受到泌乳激素的调节。gBTN1A1基因在MCF-7细胞中被定位到细胞质中,说明其主要在胞质中行发挥生物学功能。(4)构建pET-32a(+)-gBTN1A1原核表达载体, gBTN1A1基因由于内部存在大量的稀有密码子,其在BL21宿主菌中不能表达出完整的gBTN1A1,且表达量非常小。在Rosetta宿主菌中,经过IPTG诱导,能够得到全长基因的表达,Western-blot证实其具有良好的抗原性。实验证明IPTG的浓度对gBTN1A1蛋白的表达影响不大,但其表达量受温度和时间影响,30℃,诱导2 h时的表达量最大,然后开始下降,4.5 h时表达量又开始上升。(5)构建真核表达载体pcDNA 3.1/myc-His(-)A-gBTN1A1,转染MCF-7细胞,利用气相色谱质谱联用仪检测转染细胞中脂肪酸含量的变化,发现gBTN1A1基因转染细胞后,细胞内的C14:0、C18:0、C18:1含量比对照组高,而C16:0和C18:2比对照组低,其中实验组C14:0含量是对照组的1.68倍,C18:0是对照组的1.38倍,C18:1是对照组的1.23倍,而对照组的C16:0是实验组的1.08倍,C18:2是实验组的1.77倍。提示gBTN1A1基因的C-端尾巴在胞质内与脂肪酸合酶(FAS)形成复合体,降低FAS活性,影响内源性脂肪酸的合成,并且gBTN1A1蛋白表面可能存在亚油酸特异的结合位点,能够结合亚油酸从胞质分泌到细胞上清。通过MTT试验检测发现其抑制MCF-7细胞的生长。( 6)克隆gBTN1A1基因的启动子序列,并构建真核报告基因表达载体pCAT3-Basic-BTNP1和pCAT3-Basic-BTNP2,利用CAT ELISA试剂盒检测启动子活性,发现BTNP1的活性高于BTNP2。利用不同浓度的催乳素处理MCF-7细胞,发现催乳素能使BTNP1启动子活性增强,使其下游CAT报告基因的表达量增加,由此说明,催乳素参与gBTN1A1基因的表达调控,催乳素上调gBTN1A1。通过同源性分析,发现gBTN1A1基因启动子序列与牛、人及小鼠BTN1A1基因启动子序列的同源性分别为65%、36%和19%,这4个物种的BTN1A1启动子区域,不存在Inr、TATA盒、DPE、TFⅡB识别元件(BRE)和CpG岛等非常保守的核心启动子元件,说明BTN1A1基因有其独特的识别元件,四个物种相似区域的转录因子结合位点分析发现山羊和牛的转录因子结合位点比较相似,而小鼠的转录因子结合位点与其他三个物种差异很大。