研究背景:心脏纤维化是高血压、冠心病、心肌病等多种心脏重构相关疾病的共同病理生理改变,其基本的细胞生物学机制主要是心脏成纤维细胞(cardiac fibrosis,CFs)的过度增殖、迁移以及表型转化,同时伴有细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白过量积聚,最终导致心脏结构的改变。其临床表现主要为心脏顺应性下降和舒缩功能减低。因为早期缺乏明显的临床症状和有效的干预治疗手段,所以研究心脏纤维化形成的发病机制,寻找早期诊断的分子标志和临床治疗的潜在靶点,对于治疗心脏纤维化相关心脏疾病,改善预后等具有重要的意义。目前已有的研究主要认为心脏纤维化的形成和多种细胞生长因子和炎症因子的刺激导致心脏成纤维细胞异常增值、迁移和释放细胞外基质密切相关。因而CFs是心脏纤维化的直接效应细胞。大量研究发现转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)和CFs增殖迁移等异常的生物学功能密切相关,TGF-β1可提高SMADs蛋白的磷酸化水平而完成TGF-β1/SMADs信号通路的激活,最终在细胞核内完成其相应的生物学效应。由于心脏纤维化的发生发展过程中有诸多因素参与,其机制较为复杂,对于TGF-β1/SMADs信号通路在心脏纤维化的发生发展过程中的直接分子生物学机制,尤其是如何调控下游的靶基因的具体分子机制并不十分明确。表观遗传学这种基因序列外修饰是真核细胞在相同的基因组中却发挥不同的生物学功能表型的主要的调控方式之一。其涉及到染色质构象可逆性变化、DNA转录、转录后加工和剪接等多个层面调控基因表达。尤其是近年来与染色质构象可逆性变化密切相关的核小体上的组蛋白修饰对基因的表达调控有了重要的进展,提出了“组蛋白密码”的假说:即基因的表达与否与其DNA序列上组蛋白修饰-染色质重构有关。实验证实发生在组蛋白N端赖氨酸的化学修饰,是染色质构象改变可逆性的重要机制。组蛋白可通过组蛋白乙酰化转移酶(histoneacetylase,HAT)、组蛋白去乙酰化转移酶(histonedeacetylase,HDAC)和组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases,HMT)等导致DNA序列形成核小体过程中组蛋白N端修饰的多样化,使核小体进一步形成染色质过程中有紧密和松散的变化,从而调控基因的表达与沉默。因此,表观遗传调控异常导致细胞在相同基因组下不同表型谱系的细胞转化,发挥异常生物学功能与疾病的发生密切相关。近年来组蛋白修饰在多种疾病发病机制的研究领域中备受关注。其中多数研究聚焦在肿瘤的发生和药物治疗的转归领域。在肿瘤临床研究中,组蛋白去乙酰化抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)作为一类新型的抗癌药物,具有抑制细胞增殖、促进细胞分化或促进细胞凋亡的作用。而在众多如心肌缺血等心脏病模型中,也存在研究证实Ⅲ类组蛋白乙酰化酶缺失(如Sir3)可导致心肌细胞肥大,清除累积的细胞外基质能力下降。此外,HDACi组蛋白去乙酰化小分子抑制剂,可上调心肌细胞乙酰化水平,抑制血管紧张素Ⅱ的活性,进而降低心脏纤维化程度,提示HDACi在心脏纤维化的病理生理过程中可能扮演重要角色,这使HDACi成为临床上研究心脏纤维化为基础病理改变等心脏疾病的治疗及预防心源性猝死的治疗策略新的切入点。我们在前期动物实验的基础上提出假设:丁酸钠(Sodium butanoate,NaBu),一种小分子组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi),能够通过组蛋白修饰调控心脏纤维化过程中关键的信号通路TGF-β1/SMADs的活化而抑制心脏纤维化。为了证实我们的假设,设计本研究旨在明确丁酸钠(NaBu)通过组蛋白修饰表观调控模式对在心脏纤维化发生发展过程中的直接效应细胞-心脏成纤维细胞内TGF-β1/SMADs信号通路中的分子表达的影响及潜在的抑制心脏纤维化的作用和作用机制。以期从表观遗传学的角度研究和阐明NaBu在心脏纤维化的发生发展过程中的分子机制,寻求新的治疗策略和潜在的治疗靶点。研究方法:1、血管紧张素Ⅱ构建了大鼠心脏纤维化模型,采用随机抽号的方法将48只SD(Sprague Dawley,SD)大鼠分成四组,分别为:生理盐水对照组(假手术组),血管紧张素Ⅱ组,丁酸钠组,血管紧张素Ⅱ+丁酸钠组。首先,我们使用皮下植入含血管紧张素Ⅱ(500ng/kg/min)的微渗泵构建SD大鼠心脏纤维化模型,在泵植入皮下三天后用鼠尾无创八道血压检测仪检测血压,并开始每日进行丁酸钠(500mg/kg)腹腔注射。造模时间为28天。2、第28天分别对各组SD大鼠麻醉下行超声心动仪器检查,活体动物模型中观察心脏心脏纤维化的改变。3、第28天将每组12只大鼠,各取其中的6只麻醉下剪开腹腔,腹主动脉取血后用4%的多聚甲醛灌注内固定,取出心脏组织,4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片。用Masson染色和免疫组化检测心脏纤维化。另外6只麻醉后腹主动脉穿刺取血,离心后分离血清,-80度保存备用;低温取出心脏组织液氮保存,抽提组织蛋白和RNA。RT-qPCR、免疫印迹检测心脏纤维化的发生发展过程中相关基因α-SMA、Collagen I、TGF-β1、SMADs的蛋白和mRNA的表达变化。4、RNA-seq方法筛查Ang Ⅱ诱导的SD大鼠丁酸钠处理和无丁酸钠处理及假手术组的差异基因表达,并用RT-qPCR验证。5、原代分离培养乳鼠心脏成纤维细胞,分别用Ang Ⅱ和NaBu处理48小时,收获细胞,抽提蛋白和RNA。与动物实验平行检测相关蛋白和mRNA表达。6、CCK8法、细胞计数法、EdU和细胞划痕方法检测CFs的增殖和迁移情况,同时建立Ang Ⅱ和NaBu作用于细胞的量效浓度曲线。7、采用siRNA干扰和荧光素酶报告基因检测NaBu对潜在靶标蛋白的基因表达及转录的调控。8、CO-IP、WB、ChIP和RT-PCR证实丁酸钠对潜在靶标蛋白基因转录和结合的作用。研究结果:1、丁酸钠能够明显改善Ang Ⅱ诱导的大鼠心脏纤维化。超声心动图结果显示丁酸钠能够增加Ang Ⅱ舒张后左室内径(LVIDd)与减少舒张后左室后壁(LVPWd)的厚度,并对射血分数(EF)与缩短分数(FS)也有一定的影响。Masson染色结果显示NaBu+Ang Ⅱ组心脏纤维化面积明显低于Ang Ⅱ组,同时NaBu+Ang Ⅱ组心脏组织中α-SMA和Collagen I阳性染色面积也明显低于Ang Ⅱ组。以上结果表明NaBu可明显改善Ang Ⅱ诱导的SD大鼠心脏重构。2、体外实验证明NaBu拮抗Ang Ⅱ,抑制心脏纤维化与负调控SMAD3密切相关,发现NaBu下调SMAD3不依赖于TGF-β1,并与pSMAD2不相关。采用免疫印迹和qPCR方法检测心脏纤维化发生发展过程中至关重要的TGF-β1/SMADs信号通路的蛋白表达水平。结果显示,Ang Ⅱ组TGF-β1蛋白表达和NaBu+Ang Ⅱ组相比较,差异不显著(p>0.05)。进一步检测SMAD2、SMAD3,发现SMAD2和pSMAD2各组间蛋白表达水平无显著差异(p>0.05),而SMAD3和pSMAD3在NaBu+Ang Ⅱ组蛋白表达显著降低(p<0.01),提示NaBu拮抗Ang Ⅱ改善SD大鼠心脏纤维化,抑制SMAD3的蛋白表达,减少pSMAD3磷酸化水平,不依赖于TGF-β1的调控,并与pSMAD2不相关。3、NaBu拮抗Ang Ⅱ、抑制大鼠心脏纤维化与组蛋白甲基化转移酶SETD4被上调密切相关。RNA-seq筛查结果显示Ang Ⅱ组与NaBu+Ang Ⅱ组SD大鼠心脏组织中差异表达的mRNA进行比较,结果表明两组间差异表达的mRNA数有401个,其中上调的mRNA有208个,下调的mRNA有121个。进一步对这401个差异表达的mRNA进行GO富集和KEGG富集分析,分别从BP、CC和MF三大类中挑选了富集最显著(p-value水平,P<0.001)的10个进行GO富集分析,结果提示,GO富集功能中,包括了R-Smad结合蛋白,细胞粘附分子,肌动蛋白结合蛋白等相关差异表达的mRNA(R-SMAD binding,cell adhesion molecule binding,cell adhesion molecule binding)。KEGG富集分析,发现有3个与细胞迁移、增殖相关的信号通路,包括细胞骨架肌动蛋白的调节信号、Apelin信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号通路等(Regulation of actin cytoskeleton,Apelin signaling pathway,Adrenergic signaling in cardiomyocytes)。进一步选取21个差异表达最显著的mRNA进行相关性分析,发现NaBu+Ang Ⅱ组中差异表达的mRNA中,Acta2、YY1、SMAD3表达量与SETD4表达量的相关性最强。我们通过在线数据库对Acta2、YY1、SMAD3与SETD4等21个差异最显著的mRNA之间进行GO富集功能分析,发现这21差异表达的mRNA存在一定的相互作用关系。根据GO富集功能分析的差异表达的mRNA的结果,从中选择了3个上调与表观遗传修饰、细胞增殖相关的mRNA(Asmt、Setd4、Yy1),3个下调与纤维化相关的mRNA(Spp1、Smad3、TGF-β2)。利用定量PCR方法进一步分析它们在Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+NaBu组心脏组织中的表达情况。这些基因都被证实在NaBu处理后有显著的表达改变。定量PCR结果与RNA-seq结果一致,其中发现组蛋白甲基化转移酶4(SET domain 4,SETD4)mRNA显著高于Ang Ⅱ和假手术组(p<0.001),使用定量PCR方法进一步检测SETD4在心脏组织中的表达量,定量结果与RNA-seq结果一致,增强了的RNA-seq结果的可信度。4、体内外实验证实NaBu上调SETD4、负调控SMAD3抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠心脏纤维化。体外CFs中验证SD大鼠心脏组织中RNA-seq筛查的显著差异表达的mRNA。结果显示在NaBu处理组SETD4蛋白和mRNA表达水平显著高于Ang Ⅱ组,进而同时用免疫荧光和免疫印迹在CFs中检测了SMAD3、pSMAD3、α-SMA、Collagen I基因表达水平,结果显示SETD4表达水平与SMAD3、pSMAD3、α-SMA、Collagen I呈负相关。5、NaBu通过上调SETD4显著抑制Ang Ⅱ诱导的CFs的增殖迁移NaBu干预转染si-SETD4的Ang Ⅱ处理组中SETD4蛋白和mRNA水平低于转染si-NC的Ang Ⅱ对照组(p<0.001)。EdU和划痕实验结果中显示,NaBu干预转染si-SETD4的Ang Ⅱ处理组与转染si-NC的Ang Ⅱ对照组相比,NaBu拮抗AngⅡ抑制CFs增殖及迁移能力均显著下降(p<0.001)。以上结果进一步证明NaBu负调控SMAD3拮抗Ang Ⅱ与SETD4密切相关。进一步提示NaBu能够拮抗Ang Ⅱ、负调控CFs增殖迁移、改善心脏纤维化,其过程存在组蛋白甲基化修饰的表观遗传学机制。6、NaBu上调SETD4通过与YY1结合经H3K9me3在表观遗传水平抑制SMAD3的表达。RNA FISH结果显示SETD4在CFs的细胞核与细胞质中表达均较丰富。根据在线SETD的生物学功能分析及文献报道,用WB检测了NaBu和Ang Ⅱ处理CFs后中SETD4可能作用的组蛋白修饰位点,包括H3K9me、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3,结果提示NaBu上调SETD4负调控SMAD3可能经H3K9me3抑制SMAD3转录活性。根据我们对差异表达的mRNA的GO富集分析结合UCSC在线分析,发现SMAD3启动子区存在YY1结合位点,YY1是具有染色质重构酶活性的反式作用因子,干扰SETD4和YY1后,SMAD3启动子区转录活性显著上高,SMAD3表达显著增加。CHIP实验证明SMAD3启动子区有YY1的结合以及丰富的H3K9me3信号,同时SETD4和YY1可以相互结合作用于SMAD3启动子区。以上结果表明NaBu上调SETD4可以通过结合YY1经H3K9me3调控SMAD3的表达。荧光素酶报告基因实验证明干扰SETD4和YY1后,SMAD3启动子的活性升高。WB实验显示SETD4不影响YY1的表达。CO-IP实验证明SETD4可以与YY1蛋白结合,ChIP实验证明干扰SETD4降低了SMAD3启动子区YY1的结合以及H3K9me3水平。以上结果表明,SETD4通过与YY1结合上调SMAD3启动子区组蛋白甲基化水平,使其启动子区染色质结构紧密化,最终导致SMAD3转录抑制,从而在表观遗传水平上实现基因表达调控。结论:综上所述,本研究在课题组前期Ang Ⅱ诱导大鼠心脏纤维化体内外模型的基础上,进一步探讨NaBu上调SETD4负调控SMAD3的功能及机制。经研究发现:NaBu显著改善Ang Ⅱ诱导的SD大鼠心脏纤维化。体内外功能实验证实SETD4能够结合YY1经H3K9me3抑制SMAD3启动子区的转录活性。NaBu通过上调SETD4负调控SMAD3的表达发挥抑制心脏纤维化的功能。SETD4在细胞核中通过与YY1结合增加SMAD3启动子区组蛋白甲基化水平,通过改变其染色质结构的方式抑制了SMAD3基因的转录。我们的研究证明了NaBu上调SETD4抑制心脏纤维化的生物学功能。并且首次阐明了NaBu经SETD4负调控SMAD3基因表达的表观调控分子机制,为理解组蛋白甲基化修饰在心脏纤维化中的生物功能和作用机制提供了新的证据,也为心脏纤维化的治疗和预后提供了一个潜在的分子标志物。