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背景：肝细胞癌是世界上第五大常见癌症,且80%的原发性肝癌为肝细胞癌。肝细胞癌患者5年生存率低至7%,每年全世界大约超过60万人死于肝癌。肝细胞癌对于现存的化疗药物以及化疗方案极度不敏感,往往缺乏有效的治疗手段。多药耐药(1nultidrug resistance,MDR)是制约化疗药物在肝癌患者临床应用的主要障碍。肿瘤细胞多药耐药的机制复杂,已知一些遗传学和/或表观遗传学的改变能增加化疗药物从细胞中排出、减少细胞对化疗药物的摄入；激活DNA修复和药物的代谢；细胞信号通路的激活/失活；阻断凋亡通路等。大多数化疗药物,包括顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素等常用化疗药物都通过诱导细胞凋亡来发挥其抗肿瘤作用。在大多数细胞包括肝细胞,这种凋亡信号转导需要线粒体的参与。大多数肿瘤细胞高表达hTERT,故hTERT可作为临床抗肿瘤治疗的理想靶点。研究证实,hTERT表达与肿瘤细胞的耐药性相关。端粒酶作为一种反转录酶,主要在胚胎干细胞、生殖细胞和肿瘤细胞核内高表达,依赖自身模板(TERC)和催化蛋白(TERT)维持端粒的长度。研究发现,端粒酶还具有非端粒依赖的功能,如促进参与细胞生长和增殖的基因的表达[1]、DNA损伤应激反应[2]以及细胞凋亡途径的调控等等[3]。细胞中端粒酶具有多种调控方式，其中，端粒酶在亚细胞的定位是其转录后调控的方式之一。线粒体端粒酶有其特殊的作用方式。研究表明，线粒体hTERT能以线粒体RNA为模板发挥逆转录酶作用(RdDP)[4]；线粒体hTERT可以与线粒体RNA核糖核酸酶的RNA部分(RMRP)结合发挥基因沉默作用[5]；此外，线粒体hTERT可以保护线粒体功能[6]和阻止细胞凋亡[7]。因此，推测线粒体端粒酶有可能通过增强线粒体功能，阻断细胞凋亡通路参与肿瘤细胞MDR的发生。目的：本研究通过观察线粒体端粒酶表达与肝癌细胞化疗耐药的关系，探讨肝癌细胞多药耐药产生的机制。方法：采用分子克隆技术构建靶向线粒体表达hTERT的慢病毒载体PLE-mito–hTERT，采用DNA测序、激光共聚焦显微镜和Western bot检测线粒体hTERT表达,以验证载体构建的正确性；采用CCK-8试剂盒检测肝癌细胞耐药状态；免疫荧光测定caspase-3的活化状态；TMRE探针检测线粒体膜电位水平；流式检测凋亡水平；Q-PCR检测线粒体DNA拷贝数目变化；结果：1、DNA测序表明靶向线粒体表达hTERT慢病毒载体PLE-mito–hTERT构建序列正确；与HepG2(1.727±0.534)和HepG2-PLE细胞(2.687±1.280)相比，HepG2-mito-hTERT细胞(14.880±6.644)线粒体荧光共定位信号增强(P<0.01)；同样地，与SK-Hep1(0.706±0.299)和SK-Hep1-PLE细胞(0.873±0.366)相比，SK-Hep1-mito-hTERT细胞(22.24±0.558)线粒体荧光共定位信号亦增强(P<0.01)；与亲本细胞和阴性对照细胞相比，SK-Hep1-mito-hTERT和HepG2-mito-hTERT细胞核内hTERT表达水平无明显变化(P>0.05)，而线粒体hTERT表达明显升高(P<0.05)。证明靶向线粒体表达hTERT慢病毒载体PLE-mito–hTERT构建成功。2、 SK-Hep1-mito-hTERT和HepG2-mito-hTERT细胞对化疗药物CDDP、5-FU和DOX的耐受性增加。(1)1-16μg/mL CDDP组，与HepG2和HepG2-PLE细胞相比，HepG2-mito-hTERT细胞(0.120±0.018、0.320±0.006、0.499±0.018、0.555±0.019、0.623±0.006)相对抑制率显著降低(P<0.05)；(2)4-32μg/mL5-FU组，与HepG2和HepG2-PLE相比较，HepG2-mito-hTERT(0.207±0.016、0.320±0.006、0.499±0.018、0.555±0.019)耐药性显著增加(P<0.05)；(3)0.15-2.5μg/mL DOX组，与HepG2和HepG2-PLE细胞相比较， HepG2-mito-hTERT细胞(0.165±0.023、0.229±0.007、0.410±0.011、0.509±0.066、0.562±0.009)耐受性均显著性增强(P<0.05)；(4)同样地，1-16μg/mL CDDP组，与相同浓度组SK-Hep1、 SK-Hep1-PLE细胞相比较，SK-Hep1-mito-hTERT细胞相对抑制率(0.083±0.017、0.151±0.063、0.234±0.021、0.387±0.022、0.624±0.013)均有显著性差异(P<0.05)。(5)2-8μg/mL5-FU组，与相同浓度组SK-Hep1、SK-Hep1-PLE细胞相比较，SK-Hep1-mito-hTERT细胞(0.275±0.058、0.458±0.042、0.670±0.064)相对抑制率均有显著性差异(P<0.05)。(6)0.15-1.25μg/mL DOX组，与相同浓度组SK-Hep1、SK-Hep1-PLE细胞相比较，SK-Hep1-mito-hTERT细胞(0.112±0.008、0.294±0.007、0.740±0.018)相对抑制率均有显著性差异(P<0.05)。3、与阴性对照细胞相比，HepG2-mito-hTERT和SK-Hep1-mito–hTERT细胞均能减少药物应激导致的caspase-3激活(P<0.05)；此外，与母本细胞和阴性对照细胞相比，HepG2-mito-hTERT细胞能够减少多种药物诱导的凋亡(P<0.05)；4、与母本细胞和阴性对照细胞相比,HepG2-mito-hTERT细胞能减少药物应激导致的MMP降低(P<0.05)。5、与母本细胞和阴性对照细胞相比，HepG2-mito-hTERT在药物刺激前后线粒体DNA拷贝数均增加(P<0.05)；结论：hTERT线粒体过表达可增加肝癌细胞对化疗药物的耐药性；线粒体hTERT可能通过降低mtDNA损伤水平，保护线粒体功能，抑制线粒体凋亡途径的激活，参与人肝癌细胞获得性多药耐药过程。