副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原,不仅是水生动物弧菌病(Vibriosis)的重要病原,而且也是一种常见的食源性致病菌,极易引起食物中毒,严重的可引起肠胃炎等疾病。此外,Vp还可能引发伤口感染,严重的可导致败血症甚至死亡,对人类健康危害巨大。而斑马鱼作为最重要的模式脊椎动物之一,在受精之后的3周时间内只存在“天然免疫”系统,具有在器官水平和个体水平上研究天然免疫应答的独特优势。本实验主要以斑马鱼为模型,用Vp感染斑马鱼来检测不同来源的人类致病株及水产动物致病株的毒力大小,得到的强毒力菌株Vp13用于探究Notch信号分子及炎性因子、细胞因子及TLR信号通路上的关键因子在感染斑马鱼胚胎或幼体中的表达量变化,初步探究Notch分子参与天然免疫应答的作用。为了进一步探究Notch信号在Vp感染斑马鱼胚胎中的作用机制,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了notch1a及notch1b的突变体,为后续感染机制的深入研究提供了宝贵材料。本研究的主要成果有:1)本文以Vp为研究对象,建立了成年斑马鱼的感染模型,对人类致病菌株ATCC17802、Vp-KCN、ATCC33847及水产动物致病菌株Vp13、Vp31、Vp41、Vp57共7株Vp的毒力进行比较,分别用累积法及Bliss法计算LD50,发现毒力强弱的顺序均为:Vp13>ATCC33847>ATCC17802>Vp57>Vp31>Vp41>Vp-KCN。将毒力最强的Vp13菌株用于后续实验。2)用Vp13菌株采用浸泡的方式感染1dpf、2dpf、3dpf和5dpf的野生型斑马鱼胚胎/幼鱼,利用Q-PCR方法检测感染后1h(hour post infection,hpi),2 hpi,4 hpi,8 hpi,12hpi后Notch1受体(notch1a,notch1b)、Notch配体(delta a,delta b,delta c)、炎性细胞因子(il1b、il10、il6、tnfa及ifnphi)、趋化因子(ccl-c5a、cxcl-8a)和TLR信号通路上的关键因子(tlr2、tlr4、myd88、mmp9及hey1)在转录水平的表达量变化。研究结果提示:用Vp13浸泡感染1dpf、2dpf、3dpf和5dpf的斑马鱼胚胎/幼鱼,结果提示:3dpf的斑马鱼胚胎感染Vp13后notch1a、notch1b及4种配体变化趋势相似,均先降低后升高,在4hpi时达到最小值。notch1a及notch1b对TLR信号通路表现出负向调控作用。确定Vp13感染2dpf斑马鱼胚胎后4h notch基因表达量最高。Vp能够激活Notch信号通路。提示其可以参与天然免疫应答反应,为之后继续的转录组测序研究以及深入研究Notch信号在先天免疫中的作用机制提供了一定的理论依据。3)为了进一步验证Vp13所引起的斑马鱼天然免疫应答反应中Notch分子的作用机制,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功制备了notch1a和notch1b基因敲除的斑马鱼突变体,为进一步深入研究Notch分子参与的天然免疫应答机制提供了很好的实验材料。此Cas9/g RNA系统可以对notch1a、notch1b产生不同类型的突变,而且突变的效率高达70%以上。与ZFN或TALEN相比较,我们所运用的Cas9/g RNA系统是一种更简单、更经济的基因编辑方式,并且可以更有效地产生特定位点的indels(insert/deletion)基因突变。总而言之,Vp所致疾病的控制措施直接影响病程的长短,在发病早期,机体采取天然免疫应答机制对抗感染,成为现代医学的研究焦点。本研究以Vp为对象,建立了斑马鱼成鱼和幼鱼感染的动物模型,在分子水平上初步研究Notch分子参与天然免疫应答的表达变化,从而采用有效的手段、方法来控制免疫应答在适度的范围内。该研究结果可为Vp感染所致疾病的防治提供基础理论支持。