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目的:对中缅边境间日疟原虫进行分子流行病学调查,揭示其分布特征、流行规律等;为后续研究间日疟原虫复发特征、基因型与耐药关系打下基础。
方法:(1)收集06—08年云南腾冲及缅甸拉咱的间日疟原虫病例,经镜检确认,采集滤纸血样标本。(2)用Chelex—100离子交换法提取血样中的间日疟原虫基因组DNA。(3)设计合成一组间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因特异分型引物。(4)巢式PCR扩增。(5)凝胶电泳,根据特异性引物所扩增的PCR片断的有无判断结果。(6)PCR扩增间日疟原虫种特异片断,自动测序仪测序验证,分析其结构特征。(7)进化树分析。(8)收集间日疟原虫感染的病例数据,综合分析,对结果进行统计处理。
意义不同地理株的疟原虫,其生物学特性、对媒介按蚊的感染力、对人类宿主的免疫原性及对抗疟药的敏感性存在明显差异,这在一定程度上影响了疟疾的发病率和治愈率。通过基因分型可掌握疟原虫虫株的遗传学特征,提高疟疾的诊断水平,同时能够根据疟原虫不同地理株基因分型和分布情况,迅速确定疾病的来源及判断传播趋势,为防治工作提供科学依据。
结果:(1)在所检出的147份间日疟原虫样本中,热带族为70例,占总数的47.62%,温带族为65例,占总数的44.22%,混合感染为13例,占总数的8.16%,PV—Ⅱ型虫株未检出。(2)147份间日疟样本中,112例为云南腾冲样本,35例为缅甸拉咱标本,测序法显示缅甸拉咱与云南腾冲间日疟CSP基因型构成有明显差异,缅甸拉咱以温带族为优势虫株(占65.71%),云南腾冲以热带族为优势虫株(53.57%)。
结论:(1)缅甸拉咱与云南腾冲间日疟CSP基因型构成有明显差异,云南腾冲以热带族为优势虫株。(2)测序法发现云南间日疟原虫CSP基因高度变异。PV—Ⅰ型中央九肽(GDRADGQPA)重复单位发现多种突变,但仍以第五位氨基的A/D突变为主。温带族重复区后的十二肽(GGNAANKKAEDA)插入序列也发现突变,提示针对此插入序列设计的温带族特异分型引物存在一定局限性。(3)进化树分析显示,大多数间日疟云南株和缅甸株聚集在一起,并和已发表的中国株相距较远,同源性低。