目的:探讨替代细胞因子培养神经干细胞的适合技术和条件,建立神经干细胞体外培养体系,降低实验成本,为建立细胞资源库打下基础。方法:1.分离海马制成单细胞悬液。用含2%B27的DMEM/F12无血清培养液(bFGF+EGF各20ng/ml)培养细胞。采用Nestin的免疫细胞化学方法鉴定原代和传代细胞中的NSCs。免疫细胞化学方法检测诱导分化细胞的β-Tublin、GFAP。采用Brdu标记原代神经干细胞,传代后检测Brdu。采用Brdu标记神经干细胞,并进行同质小鼠大脑海马和侧脑室内移植,检测细胞存活情况。2.选择胚胎成纤维细胞、Sertoli细胞、骨髓基质细胞,建立细胞培养体系,使用10μg/ml的丝裂霉素C制备饲养层。3.实验分为五组,倒置显微镜下观察计数细胞,并绘制生长曲线。结果:1.添加细胞因子培养可以形成大量的悬浮方式生长的细胞球。细胞球经过多次传代可以形成次代细胞球。原代、次代细胞经免疫细胞化学染色检测Nestin,结果为阳性。免疫细胞化学染色分别检测分化细胞的β-Tublin、GFAP,结果为阳性。采用Brdu标记神经干细胞,免疫细胞化学检测Brdu,原代、次代NSC均为阳性。体内移植7d后在海马和侧脑室可检测到Brdu标记阳性的细胞。2.分离培养小鼠胚胎成纤维细胞、Sertoli细胞及骨髓基质细胞,并用丝裂霉素C处理,成功制备饲养层。3.三种饲养层都能使NSC增殖,在胚胎成纤维细胞、骨髓基质细胞饲养层上的生长状况优于Sertoli细胞饲养层。细胞因子组培养效果优于饲养层组,对照组细胞分化明显。结论:1.新生昆明小鼠大脑海马能分离出NSC。2.NSC大脑内移植能继续存活。3.NSC细胞在三种饲养层上均能稳定的增殖并保持未分化状态,在胚胎成纤维细胞、骨髓基质细胞饲养层上的生长状况优于Sertoli细胞饲养层。4.细胞因子组培养NSC效果优于饲养层组,但细胞因子的价格昂贵,大规模培养NSC成本过高。饲养层组可较好地模拟体内细胞生长微环境,且培养费用低廉、增殖稳定等方面较细胞因子组有优势,适宜在普通实验室推广。