论文部分内容阅读
目的神经母细胞瘤(NB, Neuroblastoma)是小儿最常见的恶性实体肿瘤之一,其恶性程度高,早期即发生转移,这不仅是神经母细胞瘤极具特点的现象,亦成为其主要的致死原因。微小RNA (microRNA,miRNA)是一类非编码小分子RNA组成的家族,能够通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译过程参与调节基因的表达,进而发挥相关生物学作用。本课题组前期研究表明miRNA-338与神经母细胞瘤侵袭与转移行为密切相关,在此基础上本实验欲通过生物信息学数据库及计算机软件分析找寻人神经母细胞瘤中miRNA-338作用的可能靶基因,并通过人为上调人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中miRNA-338的水平以探索其对细胞中可能靶基因表达的影响,从而对生物信息学预测结果进行验证,并进一步探讨miRNA-338参与调节神经母细胞瘤侵袭与转移的分子机制。方法利用TargetScan, miRanda和PicTar三个基因序列分析数据库,计算机程序根据基因序列互补结合关系预测miRNA-338的可能靶基因,并取三数据库预测结果的交集作为最终结果。在此基础上,运用脂质体作为载体将人工合成的成熟miRNA-338前体(pre-mir-338)转染入人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞,然后利用实时荧光定量RT-PCR检测转染前后各组细胞miRNA-338的表达水平的变化以鉴定转染效果,同时明确适宜的转染条件。后应用半定量RT-PCR及Western-blot蛋白印迹法分别从mRNA水平和蛋白水平检测转染前后细胞中可能靶基因表达的变化。实验结果所得数据采用统计学软件包SPSS17.0进行相关统计学分析。结果利用生物信息学数据库分析预测到"XCR4(C-X-C chemoking receptor type-4,趋化因子受体4)可能为miRNA-338作用的靶基因。经过实时荧光定量RT-PCR检测空白对照组、空载脂质体对照组(空载对照组)及各实验组细胞miRNA-338基因含量,发现转染了pre-mir-338终浓度分别为lOnM/L,30nM/L,50nM/L和100nM/L的各实验组SH-SY5Y细胞中miRNA-338含量分别为空白对照组的1.32倍,1.62倍,1.90倍及1.86倍,实验组较空白对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05),而空载对照组miRNA-338的含量为空白对照组的1.00倍,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。从而成功将pre-mir-338转染入细胞达到miRNA-338过表达的目的,并探索出pre-mir-338转染浓度50nM/L为较佳转染浓度。经实验证实细胞内miRNA-338含量依次递增的转染组(10nM/L组、30nM/L组、50nM/L组)CXCR4基因mRNA相对光密度值分别为0.75±0.06、0.58±0.08、0.24±0.05,依次降低,均明显低于空白对照组1.11±0.08,空载对照组1.04±0.08(p<0.05),证实miRNA-338明显抑制了SH-SY5Y细胞内CXCR4基因的转录。而通过Western-blot蛋白印迹法从蛋白表达水平进一步检测转染效率最高的50nM/L组细胞的CXCR4蛋白相对表达量为0.24±0.06,而未转染的空白对照组为0.56±0.08,miRNA-338含量高的转染组较含量低的未转染组CXCR4蛋白表达明显下调,组间差异有统计学意义(P<0.05),证明miRNA-338明显抑制了SH-SY5Y细胞内CXCR4蛋白的表达。结论人工合成的pre-mir-338可成功转染入人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞造成miRNA-338过表达。miRNA-338能够下调神经母细胞瘤细胞CXCR4mRNA及蛋白的表达参与调节肿瘤的侵袭与转移,而利用生物信息数据库寻找miRNA相关靶基因的方法亦可行,结果可信度较高,人工合成的pre-mir-338有望通过替代方式为神经母细胞瘤的治疗提供新的途径。