水稻(Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都以水稻为主食。随着人口的增加和可耕地面积的减少，粮食的供需变得越来越不平衡，幸运的是，杂交水稻可以比常规优质水稻提高20-30％的产量，在弥补粮食短缺的问题上起到了非常重要的作用。根据不育系类型的不同，杂交水稻的育种方法分为三系法和两系法。与三系法相比，两系法可以一系两用，在高温条件下，可将温敏不育系作为不育系；在低温条件下，又可将温敏不育系作为保持系，而且任何正常水稻品种都可以作为恢复系。多年来，尽管已选育出一大批水稻两用核不育系，并有许多优良组合被应用于生产，然而控制水稻光/温敏不育的分子机理仍然不清楚。针对以上问题，本研究以生产上广泛应用的两个温敏不育系安农S-1和培矮64S为材料，分别定位和克隆了控制这两个水稻温敏不育性的基因，并对其不育机理进行了深入研究。研究取得了以下两部分结果。　　1.安农S-1温敏不育基因tms5的克隆与分子机理研究。　　安农S-1是第一个被发现的温敏不育系，其花粉母细胞到减数分裂时期处于25℃以上时表现为不育，而低于这个温度时育性恢复，而其它时期对温度不敏感。细胞学观察显示，高温诱导安农S-1花粉母细胞细胞质液泡化是导致其花粉败育的直接原因。　　安农S-1温敏不育受一对隐性基因tms5控制。本研究利用2个F2群体，将控制安农S-1温敏不育的基因tms5定位在第2染色体BAC克隆OJ1006_D05上ANIDL76和IDLPL3之间6.9 kb的区间内。序列分析表明，此区间内存在一个编码RNase Z的基因，该基因编码区的第71位碱基由C突变成A形成了提前的终止密码。Western blot检测显示，安农S-1内未检测到TMS5蛋白。实时定量PCR分析显示TMS5是一个组成型表达的基因，且轻微受温度诱导表达。功能互补和RNA干扰试验证明该基因的突变确实导致水稻温敏不育。我们将该基因命名为OsRNase Zs1。RNA干扰TMS5转基因植株(TMS5i)在高温下的花粉育性与其内源的TMS5表达量成正相关。根据这一特性，我们利用反义RNA技术创建了适用于生产实践的人工温敏不育系。　　切割试验显示，TMS5和它的同源蛋白一样在体外具有加工pre-tRNA3’尾巴的内切酶活性。但是，由于TMS5定位于细胞质中，而核编码的pre-tRNA的加工发生在细胞核中，因此温敏不育系中TMS5的缺失并没有导致pre-tRNA的加工异常。基因芯片分析发现，与野生型水稻相比，在高温下的温敏不育系中，3个编码ubiquitin-ribosomal L40e(UbL40)家族蛋白的基因(UbL401、UbL402和UbL404)表达量上升，而在低温下的温敏不育系中这三个基因的表达量没有显著变化。RT-PCR检测显示UbL40在温敏不育系中的表达受温度诱导。降解组测序暗示，UbL40在温敏不育系中的mRNA表达量上调是由于不能被TMS5降解引起的。体外切割实验说明TMS5对UbL40 mRNA具有直接而特异的切割活性。在野生型水稻中过量表达UbL40导致转基因后代花粉败育，且其败育特征与安农S-1类似。进一步的Western blot分析显示，不育系中可溶性泛素化蛋白减少而不可溶性泛素化蛋白增加。　　根据上述结果，本研究提出了安农S-1温敏不育的分子机理。低温下生长的安农S-1的UbL40 mRNA表达量较低且与野生型类似，因此其花粉育性正常；高温下，野生型水稻中受温度诱导的TMS5能够及时降解受温度诱导的UbL40 mRNA，因而维持花粉正常发育；不育系中，受温度诱导的UbL40 BmRNA不能被功能缺失的TMS5及时切割而导致其表达水平升高，进而可能影响细胞内泛素平衡，引发花粉母细胞液泡化，最终导致花粉败育。　　2.培矮64S温敏不育基因p/tms12-1的克隆。　　农垦58S是第一个被发现的光敏不育水稻，其主要表现为长日下花粉败育，短日下花粉育性恢复。培矮64S是由农垦58S转育而来的温敏不育系，由其育成的杂交水稻是当今中国种植面积最大的两系杂交稻。　　本研究中，遗传分析显示培矮64S的温敏不育性受一对主效基因控制和多个微效基因修饰。利用培矮64与培矮64S杂交的F2群体，将这个主效基因定位在第12染色体PA301和PAIDL2之间5.8 kb的物理区间内。序列分析显示该区间内非编码区的一个点突变可能导致了农垦58S的光敏不育性和培矮64S的温敏不育性，因此将该基因命名为p/tms12-1。将来源于野生型水稻的10.4 kb和8.9 kb的片段转化农垦58S恢复了其长日下的花粉育性，这2个片段包含了定位区间并且有一个2.4kb的重叠，唯一的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)也存在于这个重叠区。这意味着P/TMS12-1可能是该2.4 kb区间内的一个非编码RNA。全基因组small RNA测序和5’/3’RACE试验发现该区间内存在一个21nt的small RNA，唯一的C→G的点突变位于该smallRNA的第11位碱基处。将野生型和不育系中的该small RNA分别命名为osa-smR5864w和osa-smR5864m。进一步的5’和3’RACE试验克隆到了该small RNA的前体RNA，二级结构分析显示其结构不像一个典型的miRNA前体的结构。基因芯片分析显示，与野生型相比只有2个基因(TPC1和Os04g0175900)的表达量在长日高温下的农垦58S和培矮64S中都上调。在野生型水稻中过量表达这2个基因导致其花粉育性下降。这些结果显示osa-smR5864w可能在环境调控水稻花粉发育方面起到重要的作用。　　根据上述结果本研究克隆了2个水稻温敏不育基因，揭示了温敏不育的分子机理，同时，发现了一种新的泛素调控机理。