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环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,c GAS）为天然免疫识别受体家族中细胞内DNA感受器,通过干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes,STING）介导下游免疫反应,构成c GAS-STING天然免疫信号通路,在调控I型IFN产生和抵御DNA病毒感染中发挥重要作用。鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）感染可导致宿主急、慢性损伤和免疫抑制。迄今为止,关于CAV通过调控免疫信号通路影响I型干扰素产生的分子机制尚未清楚。本研究通过克隆表达鸡c GAS-STING通路中相关分子,构建双荧光素酶检测系统,应用细胞转染、免疫共沉淀等方法,研究CAV衣壳蛋白VP1影响c GAS-STING通路信号的传导从而影响IFN-β产生的分子途径,探析该病毒感染抑制IFN-β产生的潜在的分子调控机制。1.c GAS-STING通路相关分子的基因克隆、蛋白表达与抗体制备以鸡淋巴细胞MDCC-MSB1的c DNA为模板,通过特异性引物应用RT-PCR扩增c GAS-STING通路中c GAS、STING、TBK1（TANK-binding kinase 1）和IRF7（Interferon regulatory factor 7）编码区的基因片段,连接原核表达载体p ET32a（+）并转化E.coli Rosseta感受态细胞,对重组菌通过IPTG诱导蛋白表达,以切胶法纯化融合蛋白并制备疫苗,经皮下多点注射免疫新西兰兔,制备兔源多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体水平,应用Western blot检测其对抗原的识别。结果显示,制备的多克隆抗体（anti-c GAS、anti-STING、anti-TBK1和anti-IRF7）抗体效价为1:256000、1:512000、1:256000和1:512000,且能有效识别相应蛋白。2.CAV感染淋巴细胞诱导c GAS-STING通路传导基因的转录表达以101.33 TCID50 CAV病毒感染MDCC-MSB1细胞,通过RT-q PCR检测病毒感染后0～24h细胞内c GAS、STING和IFN-β基因转录情况。结果显示,在病毒感染后12 h时,细胞中c GAS和STING m RNA的转录水平显著增加（p<0.001）,然后在24 h时下调。这表明在病毒感染早期,c GAS、STING受到刺激后表达升高,但随后被抑制。此外,IFN-β转录水平被抑制（p>0.05）。由此说明,CAV感染可显著激活c GAS和STING表达但抑制IFN-β的表达。3.VP1靶向作用于c GAS-STING信号通路中接头分子IRF7为了探明VP1影响c GAS-STING信号通路的靶分子,本研究以鸡DF-1细胞DNA为模板,通过PCR方法扩增c GAS、STING、TBK1、IRF7和IFN-β启动子基因片段,构建相关启动子双荧光素酶报告基因检测系统,通过过表达STING或ISD（Interferon stimulatory DNA）刺激IFN-β和通路信号,分析VP1对IFN-β、TBK1或IRF7启动子活性的影响。结果显示,VP1显著抑制IFN-β启动子活性（p<0.05）和IRF7启动子活性（p<0.05）,而不影响其上游接头分子TBK1（p>0.05）。这表明VP1可能通过靶向IRF7抑制IFN-β信号传导途径。为了明确VP1对IRF7及IRF7关键结构域的靶向作用,本研究首先构建p CMV-Myc-IRF7、p CMV-Myc-IRF7-DBD（aa 1-143）和p CMV-Myc-IRF7-△DBD（aa143-492）重组质粒;其次,将VP1与IRF7或与IRF7-DBD或IRF7-△DBD共同过表达至HEK293T细胞,以Co-IP和Western blot检测分析IRF7以及IRF7结构域和VP1蛋白之间互作情况。结果显示,VP1可与IRF7共沉淀且与IRF7-△DBD发生共沉淀,不与IRF7-DBD结构域结合。由此表明,VP1通过结合IRF7以此调控c GAS-STING通路,且IRF7-△DBD是其结合的关键结构域。综上所述,本研究首先表达了鸡c GAS-STING通路中接头分子并制备了相应兔源多克隆抗体;其次,发现CAV感染可诱导宿主细胞中c GAS、STING但抑制IFN-β的表达;继而通过建立双荧光素酶报告基因系统明确了CAV结构蛋白VP1能显著抑制IFN-β表达,且其靶向调控IRF7及其IRF7-△DBD结构域。通过上述研究,明确了VP1通过与IRF7相互作用影响c GAS-STING通路干扰IFN-β的产生,有助于理解CAV免疫逃逸的分子机制。