目的:1在联合百日咳佐剂条件下,空肠弯曲菌的灌胃频率是否对Hartley豚鼠的周围神经损伤有影响。2为进一步完善空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,Cj)经自然途径感染Hartley豚鼠致周围神经病的动物模型及研制疫苗提供依据。方法:1菌株的选择:从空肠弯曲菌菌株库中选取lulei株作为实验菌株。2菌悬液的制备:对冻存的空肠弯曲菌lulei株进行复苏、传代,及形态、生化学鉴定,菌株纯化后配制成3×108cfu/ml的空肠弯曲菌布氏肉汤菌悬液。3实验动物的分组:将SPF级健康的4周龄Hartley豚鼠32只,经适应期饲养1周后,依据体重、体重增长速度及是否容易灌胃等条件筛选出28只健康的豚鼠。随机分为2个实验组和1个对照组,实验组根据空肠弯曲菌lulei株的不同灌胃频率分为A组和B组。实验组每组12只豚鼠,对照组4只。依据不同的解剖时间(末次灌喂后第6、12、18、24天)将实验组和对照组随机分为4个亚组,即A1、A2、A3、A4;B1、B2、B3、B4;C1、C2、C3、C4。实验组每个亚组3只豚鼠,对照组每个亚组1只豚鼠。4攻毒方案:各组Hartley豚鼠均在第1次灌胃后的当天和第7天,2次腹腔注射1μg/ml的百日咳毒素(pertussis toxin,PT)0.5ml。实验组A组每隔1天灌胃1次,共10次,实验组B组每隔2天灌胃1次,共7次,对照组C组为仅腹腔注射百日咳毒素。Hartley豚鼠在每次灌喂前均禁食12小时、禁水3小时。A、B组每只Hartley豚鼠每次均灌喂3×108cfu/ml的空肠弯曲菌菌悬液2ml。灌喂后立即给予Hartley豚鼠食物和水。5实验动物的观察:自适应期起每天观察Hartley豚鼠的活动情况、日常的精神状态、皮毛色泽、声音及是否有腹泻等,并定期称量体重。采用重复测量方差分析法,比较各组Hartley豚鼠的体重变化有无统计学差异。6取材:于末次灌喂后第6、12、18、24天分批解剖相应的组别,即第一次A1组、B1组、C1组,第二次A2组、B2组、C2组,第三次A3组、B3组、C3组,第四次A4组、B4组、C4组。4%水合氯醛(10ug/g)麻醉豚鼠,4%多聚甲醛灌注解剖后,分别取双侧坐骨神经近端保存于4%多聚甲醛中,择期进行锇酸染色、HE染色及Luxol-fast-blue镀银染色。7坐骨神经病理观察及统计:每只豚鼠的右侧坐骨神经经两次取材石蜡包埋后进行HE染色及Luxol-fast-blue镀银染色观察神经病理改变。每只豚鼠的左侧坐骨神经经锇酸染色后,随机分离100根神经单丝,单盲法在光镜下进行观察,并计算出有病变的神经单丝个数,计算其发病率(周围神经单丝病变率=病变单丝数/100*100%),采用统计学软件SPSS13.0根据病变率进行χ2检验,比较各组的周围神经单丝病变率有无差异及实验组各亚组的周围神经单丝病变率有无差异。结果:1实验动物的观察1.1临床症状Hartley豚鼠经空肠弯曲菌口服灌胃后,根据临床症状评分标准(参考Hartley豚鼠EAN模型的评分标准)进行评分均为0级。第四次灌胃后第2天(即首次灌胃后第8天),实验组A组的25号、30号、32号和27号出现运动减少、抓其时挣扎力弱,27号还出现声音音量减低。上述豚鼠均于2天后恢复正常。末次灌胃后第6天(即首次灌胃后第22天),32号豚鼠出现臀部脱毛现象,于其后第9天开始好转,到解剖前仍未完全恢复。1.2体重经重复测量单因素方差分析后,实验组豚鼠的体重和对照组无显著差异,P>0.05。2周围神经病理表现2.1锇酸染色实验A组和B组Hartley豚鼠坐骨神经均可见神经单丝粗细不均,髓鞘向内侧突起、节段性皱缩、缺失;髓鞘内有卵圆状物质沉积和虫蚀样缺损,多见于郎飞氏结处;髓鞘外侧成锯齿状突起,呈“长城样”改变。实验组B组52号鼠分离出较为明显的“华勒样变性”的神经单丝。对照组Hartley豚鼠坐骨神经可见神经单丝边缘光滑,粗细均匀。2.2 HE染色实验组可见轴索的断裂、缩窄,髓鞘的缺失。对照组可见轴索光滑、粗细均匀。2.3 Luxol-fast-blue镀银染色镀银染色可见:实验组轴索的断裂、缩窄。Luxol-fast-blue镀银染色可见:实验组轴索的断裂、缩窄,髓鞘的缺失。3周围神经单丝病变率的统计分析实验组中存在周围神经损伤的豚鼠占豚鼠总数的100%。对照组神经单丝病变率为4.75%,实验组A组、B组神经单丝病变率分别为45.58%、32.17%。其中A组17号豚鼠和B组57号豚鼠神经单丝病变率分别为34.00%、45.00%。据统计图显示其可能为离群值。剔除离群值后,对照组神经单丝病变率仍为4.75%,实验组A组、B组神经单丝病变率分别为46.64%、31.00%。采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析:1.未删除离群值时,对各组Hartley豚鼠坐骨神经单丝的病变率进行χ2检验。得出P<0.05(χ2=226.055),认为三组豚鼠神经单丝的病变率不全相等。进一步行组间比较,采用χ2分割法,检验水准取α=0.05,校正后检验水准α′=0.0167。两两比较可见:A组神经单丝的病变率>B组>C组,且统计学存在差异。2.删除离群值后,得出P<0.05(χ2=236.430),认为三组豚鼠神经单丝的病变率不全相等。两两比较可见:A组神经单丝的病变率>B组>C组,且统计学存在差异。所以,无论是剔除离群值前还是剔除后,A组神经单丝的病变率>B组>C组。依据不同的解剖时间点,实验组A组各亚组A1、A2、A3、A4的神经单丝的病变率分别为43.33%、45.67%、49.00%、44.33%。实验组B组各亚组B1、B2、B3、B4的神经单丝的病变率分别为30.00%、35.33%、29.00%、34.33%。采用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验。双侧性检验,检验水准取α=0.05。1.对A组的4个亚组进行统计分析,P>0.05(χ2=2.214),认为统计学无差异。2.对B组的4个亚组进行统计分析,P>0.05(χ2=4.048),认为统计学无差异。所以,可以认为在攻毒完成后的24天内,周围神经单丝的损伤维持在一个较为恒定的水平,不存在加重与减轻的趋势。结论:1从空肠弯曲菌菌株库中选取的lulei株经口服灌胃能导致所有的豚鼠都出现周围神经损伤。2在联合百日咳佐剂条件下,增加空肠弯曲菌的灌胃频率可使Hartley豚鼠的周围神经损伤加重。3周围神经的自我恢复时间超过24天。