从复杂料液中分离单一种类蛋白是一项非常艰巨的任务,需要经过一系列分离纯化步骤才能实现。与传统的化学产品的分离纯化相比,蛋白质纯化拥有明显的不同。首先,蛋白质对于外部条件非常敏感,剧烈的变化会造成蛋白质三维结构的破坏,因此要求蛋白质纯化过程温和可控。其次,目标蛋白所在的培养液中的含量通常较低,而且存在大量的杂质成分,这给蛋白质纯化造成了较大困难,收率低、成本高,因此选择合适的蛋白质分离纯化技术具有重要意义。在各种蛋白质分离纯化方法中,层析技术是最重要的一类,该技术始于1906年Mikhail Tswett的发现。根据操作模式的不同,层析技术可以分为固定床、流化床以及扩张床。固定床是最为传统的层析操作模式,技术成熟,分辨率高,但是含有颗粒的料液会导致固定床床层堵塞,因此进入固定床的料液需进行前处理。流化床则可以直接处理含有颗粒的料液,但是流化床中沟流,返混现象严重,导致流化床分离效率较差,回收率低。扩张床是一种新型的层析操作模式,和流化床一样,可以实现从含有颗粒的料液中直接分离目标蛋白,扩张床床层与固定床相似,保持了相对稳定,因而保持了较高的分辨率和较好的分离效果。扩张床结合了固定床和流化床的优势,将固液分离、初步纯化以及蛋白浓缩集成为一个单元,是一项非常有潜力的新型集成化层析技术。扩张床的基本操作流程如下：首先,平衡缓冲液从床层底部以一定流速通入,在自下而上的液流作用下,具有一定的粒径与密度分布的介质向床柱上部移动,床层发生膨胀。当重力、阻力、拖曳力等作用力达到平衡时,不同粒径和密度的介质颗粒停止运动,停留在床层不同高度在床柱中形成稳定的床层分布。当床层稳定膨胀并完成平衡后,切换通入料液,料液中的颗粒物质,如细胞或细胞碎片等,可以通过颗粒之间存在空隙,而不堵塞床层,目标蛋白则被介质颗粒吸附。然后切换回平衡溶液,对床层进行冲洗,将未吸附的蛋白与杂质冲走。之后以洗脱液洗脱介质吸附的目标蛋白。完成洗脱后对床层进行再生和冲平衡,进入下一循环。由此可见,特殊设计的介质是实现扩张床运行的基础,决定了扩张床的吸附性能和分离效率。在用于制备扩张床介质的各类材料中,纤维素是一种优秀的备选对象。但是传统的纤维素介质主要通过纤维素黄酸酯方法来制备,反应条件苛刻,过程难以控制,且需要昂贵的试剂,一些副产物对环境有害。因此,本论文采用了N-甲基氧化吗啉(N-methyl morpholine oxide, NMMO)作为非衍生化“绿色”溶剂,直接溶解纤维素,并添加碳化钨作为增重剂,制备成纤维素-碳化钨复合微球基质。在吸附模式的选择上,本文选择了疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography, HCIC)。HCIC是一种新型的层析技术,与其他传统的层析技术相比,HCIC拥有以下优势：其一、HCIC介质具有较好的耐盐吸附能力,可以在较宽的盐浓度范围没保存良好的吸附性能,因此无需对料液进行加盐后稀释操作,节省前处理过程；其二、洗脱条件较为温和,减少了抗体变性或聚集的情况；其三、HCIC介质性质稳定,可以承受较为苛刻的再生条件；其四、HCIC配基结合牢固,不会污染目标产物。因此,本文选择HCIC配基2-巯基咪唑(2-mercaptoimidazole, MI)偶联到纤维素基质上,制成疏水性电荷诱导层析介质,考察了新介质的蛋白吸附性能,并应用于免疫球蛋白G (IgG)的分离纯化。具体研究内容如下：(1)纤维素是地球上最为丰富的聚合物,是植物细胞重要的组成成分。纤维素是由葡萄糖组成的线性多聚体,含有大量氢键,是制备多孔颗粒基质的潜在材料。但是大量氢键的存在导致纤维素形态稳定,为了更好地利用纤维素进行制备,首先要对纤维素进行溶解。但是传统的溶解方法,比如纤维素黄酸酯方法,存在诸如成本过高或环境污染等不足。NMMO是一种无毒的、环状、脂肪族叔胺氧化物,常被用作有机合成中的氧化物。因为N-O的存在,NMMO拥有高度的极性,可溶于水,并形成氢键。基于这些特性,NMMO被研究者用于溶解纤维素,取得了良好的效果。本文使用NMMO作为溶剂,配合反相悬浮法制备纤维素-碳化钨复合微球,具体过程见图1。具体制备方法如下：使用NMMO作为非衍生化溶剂,在高温条件下直接溶解纤维素,加入碳化钨作为增重剂,充分搅拌混匀。为了防止与外界空气进行水分交换,整个反应体系置于干燥氮气环境下,同时加入抗氧化剂防止NMMO的降解。之后将纤维素-碳化钨悬浮液转入水相中,继续搅拌,同时降低温度,使纤维素结晶成球。在制备过程中,研究了纤维素溶解温度和时间、纤维素/NMMO/水混合溶液中的水含量、纤维素浓度、分散体系以及冷却过程对制备纤维素微球的影响。结果显示,纤维素的溶解度随着温度的提高以及时间的增加而增加,对于4 wt%纤维素溶液,105～110℃、反应30 min较为合适,进一步提升温度,则会造成NMMO的降解,不利于纤维素溶解。含水量对纤维素/NMMO/水混合溶液形成均一溶液非常重要,研究发现11～15 wt%的含水量较为适宜,低于11 wt%或高于15 wt%,都会导致难以成球。纤维素浓度影响结果显示,随着纤维素浓度加大,溶解时间延长,而且由于黏度过大,同样会导致难以成球。在分散体系控制中,油相与纤维素溶液的比例,分散剂的选择以及搅拌速度是三个重要影响因素。当转速过大或油相过少是,纤维素液滴的碰撞机率加大,不利于成球。对于冷却过程控制的研究发现,NMMO在该过程中起主导作用。综合以上研究,确定了最终优化操作条件为：105℃,30 min进行溶解反应；纤维素/NMMO/水混合溶液的含水量为11～15 wt%：纤维素浓度为4%w/w；分散体系油相比例为3-6,转速700～1000 rpm,分散剂使用4% w/w Tween 80;冷却过程为每20 min下降5℃,下降范围为105℃至10℃。按照此条件,最终制得了具有良好的球形度、合适粒径分布的复合微球,经筛分得到了粒径较大的Cell-TuC-N-L微球和粒径较小的Cell-TuC-N-S微球,湿真密度约1.6-1.7g/mL,含水率48～53%,孔隙率80～90%,孔容分别为1.05～1.13mL/g (Cell-TuC-N-L)和0.92～1.08 ml/g Cell-TuC-N-S),孔道半径为72～91nm,比表面积为17.64～23.25m2/mL。与传统的纤维素黄酸酯化法相比,本论文所采用的NMMO直接溶解纤维素新方法具有更好的环境友好性,可以节省制备时间,显示出规模化制备的应用潜力。(2)扩张床作为一种新型的生物分离技术,稳定的膨胀床层对该技术的吸附性能和分离效率有重要影响。因此考察制备的新介质在扩张床中的膨胀性能以及床层扩散程度对评价该介质是否适合作为扩张床介质是必要的。衡量床层扩散程度的参数主要包括：理论塔板数(N)、理论塔板高度(HETP)、Bo准数,和轴向扩散系数。前两者来源于与流化床相似的理论塔板数模型,后两者来源于轴向扩散模型。4个参数都基于停留时间分布(RTD)实验的结果计算获得。N和HETP对床层轴向扩散的描述简单直观,N越大,HETP越小,床层轴向扩散程度越小；对于Bo准数而言,一般认为当Bo大于40时,可以认为液相近似为平推流,轴向扩散程度低。而对于Dax而言,当数值位于10-5 m2/s水平或以下时,可以认为床层稳定,轴向扩散程度低。通过4个参数的测定,可以获得扩张床床层轴向扩散程度较为准确的认识,评价介质用于扩张床操作的潜力。对于本文制备的纤维素-碳化钨复合微球Cell-TuC-N-S,膨胀特性结果显示,Cell-TuC-N-S具有良好的膨胀性能,膨胀率随着流速增加而增加。在膨胀率2-3范围内,操作流速可高达1100～1800 cm/h,与常见的商业化扩张床吸附基质Streamline系列(200～400 cm/h)和Streamline Direct (400～800 cm/h)相比,在提高操作流速上具有显著的优势。同时测定了轴向扩散性能,实验结果显示,随着流速增加,理论塔板数和理论塔板高度分别发生一定程度的下降与上升,说明流速提升会增加轴向扩散程度。Bo准数的测定显示,随着流速上升,Bo准数仅从127下降到94,明显高于床层稳定的40；而各流速条件下,轴向扩散系数Dax数值维持在10-5m2/s水平,说明Cell-TuC-N-S扩张床在总体上处于稳定状态,其轴向扩散程度较低,适合用于高流速条件的扩张床操作。(3)抗体作为重要的生物产品,已经成为的分离纯化技术的典型对象。目前用于抗体分离纯化的手段主要为Protein A亲和层析。该技术拥有出色的选择特异性,可以实现抗体高效高纯度的分离纯化。但Protein A亲和层析也有其不足之处,比如高昂的成本,苛刻的洗脱条件等。为此,近年来研究者开发了多种新型的分离技术,希望能够改善和弥补Protein A亲和层析的不足。疏水性电荷诱导层析(HCIC)就是一种新型的层析技术,它的配基可以将多种作用力结合在一起(通常为疏水作用和静电作用),其吸附作用呈现pH依赖性。即在中性条件下,HCIC的配基不带电荷,以疏水作用吸附目标蛋白；在酸性条件下,HCIC的配基和目标蛋白带有相同电荷,从而产生静电排斥力,解吸蛋白。因为独特的吸附原理,HCIC成为一种非常有潜力的抗体分离技术。本文采用二乙烯砜活化了制备得到的Cell-TuC-N-S基质,偶联上了新型的HCIC配基2-巯基咪唑(MI),制备成具有疏水性电荷诱导层析基团的Cell-TuC-N-S-DVS-MI介质,并考察抗体IgG在该介质上的吸附行为。制备原理如图2所示。首先对制备的活化过程进行优化,考察了二乙烯砜用量、pH和反应时间对活化过程的影响。在考察二乙烯砜用量影响时表明,随着用量增加,基质活化密度上升,在用量比例达到0.6-0.8后,活化密度趋于稳定；在研究pH对活化的影响发现,活化密度在pH 11时到达最大值；而反应时间影响结果显示,在反应进行3h后,基质活化密度不再上升,说明此时反应趋于饱和。综上考察结果,确定了活化反应条件为二乙烯砜用量比例1.0,pH 11,反应时间4 h,由此获得了Cell-TuC-N-S-DVS的活化密度为100μmol/mL的基质。在对该基质活化的基础上,偶联上配基MI。本文以3倍于活化基团的MI的摩尔比例用量进行反应,偶联上所要的配基MI,制得的Cell-TuC-N-S-DVS-MI的配基密度为60μmol/mL介质。采用新制备的Cell-TuC-N-S-DVS-MI进行了抗体吸附试验,以IgG为模型蛋白,测定了其静态吸附平衡数据,考察了新介质的蛋白吸附行为。结果发现,IgG吸附受pH影响显著,合适吸附pH值为7.0和8.0,饱和吸附容量Qm分别达到77.68和78.02 mg/mL介质；当pH下降至4.0时,IgG吸附容量显著下降。分析了pH值影响的主要原因,当pH处于IgG的等电点和配基的pKa以下时,IgG和配基之间存在静电排斥作用,导致蛋白质的解吸,符合HCIC的典型特征。(4)IgG是一种分子量为150 kDa左右的大生物分子,pI值为6-8左右,包含两条重链与两条轻链,分别为50 kDa和25 kDao IgG是免疫系统中最重要的一类抗体,广泛存在于血清和组织液中,有超过一半的抗体属于IgG。因此,IgG产品拥有非常高的应用和研究价值。如果采用传统的沉淀或过滤方法分离IgG,获得的IgG纯度较低,活性也较差,限制了IgG的应用。而在Protein A亲和层析分离IgG时,需要采用过酸的溶液进行洗脱,容易破坏IgG的活性。而文献以及我们实验室前期的研究表明,HCIC层析是一项非常有潜力的抗体分离手段,如商业化HCIC介质MEP HyperCel已经成功应用于抗体的分离。本文中制备的新型HCIC介质Cell-TuC-N-S-DVS-MI也显示了对IgG分离的潜力。为了证明新型介质Cell-TuC-N-S-DVS-MI分离抗体的可行性,以猪血浆中IgG作为分离对象,基于前期静态平衡吸附实验结果,采用固定床层析进行分离。血浆料液以pH 7.0上样,在酸性条件下进行洗脱,考察了洗脱液pH的影响,pH的范围为4.0、3.6、3.4和3.0,同时比较了用硫酸铵进行前处理后对分离效果的影响。结果显示,大部分杂质可在穿透阶段流出,采用pH 4.0～3.0条件下洗脱,IgG纯度可达80%以上,pH3.6洗脱可获得最大纯度为89.4%,纯化因子为3.35。其层析结果和电泳结果见图3。用硫酸铵对原料进行前处理后,可以显著提升IgG的回收纯度。其主要原因在于,高盐浓度会破坏蛋白质的表面水化层,增强了配基与IgG之间的疏水作用。以上结果表明,以MI为功能配基的新型HCIC介质可以从复杂的血浆料液中高效分离IgG,具有潜在的应用前景。本文还尝试了将介质Cell-TuC-N-S-DVS-MI用于扩张床吸附分离血浆料液中IgG。实验中发现,所制备的介质比较容易发生破碎,导致碳化钨泄漏。这一现象的原因分析认为,一是操作流速过高,二是介质的机械强度不足。介质机械强度发生下降可能是由于活化与偶联过程导致纤维素基质结构发生变化。总之,本论文围绕新型纤维素复合基质的制备、功能化以及蛋白分离应用,展开了系统研究,获得了一些有价值的结果,为新型介质开发和抗体分离纯化提供一定的指导。基于本文工作,后续可以从以下几个方面进行进一步的研究：(1)虽然NMMO是一类非衍生溶剂,具有良好的环境友好特性,但是在本文研究过程中发现,NMMO可能造成纤维素氧化以及结构改变,不利于基质后期偶联配基反应。所以需要进一步寻找其他更合适的溶剂,用于溶解纤维素。(2)对于纤维素球的制备而言,冷却过程的控制非常重要。本文中考察并优化的制备条件仍然有限,需要对更多的溶剂和再生方法进行尝试,从而进一步改善纤维素球的制备过程。(3) SDS-PAGE结果显示IgG的洗脱峰中仍然残留一定数量的白蛋白与纤维蛋白原,影响了IgG的纯度,所以有必要进一步改进IgG的分离纯化过程。可以通过增加膜过滤等前处理手段进行改善。(4)本文中仅偶联了一种HCIC配基MI,后续研究中应尝试更多的HCIC配基,从而比较不同配基对分离纯化效果的影响。(5) Cell-TuC-N-S-DVS-MI以扩张床模式分离血浆料液中IgG,效果不是很好,应对该现象进行进一步研究,确定原因。并对介质机械强度不理想的情况进行改善。