研究背景二硫化碳（Carbon disulfide,CS₂）是一种常用的粘胶纤维工业合成品原料,普遍应用于服装行业。服装行业是一种以女性工作人员占主导的劳动密集型产业。近年来,CS₂对女性生殖系统的影响引起普遍关注。流行病学调查研究发现,CS₂职业暴露的女性较非职业人群生殖系统方面会受到不同程度的损害。本课题组前期对职业女工的流行病学调查研究发现,同对照组女性人群相比,CS₂暴露的职业女工人群表现出高的早早孕丢失以及受孕时间明显延迟等特点。同时,小鼠动物实验发现,CS₂生殖毒性作用最为敏感的时期是胚胎植入期。由此可见,CS₂具有明显的生殖毒性,并会影响胚胎植入,但其机制尚不清晰。母胎界面的免疫微环境保证了容受性子宫内环境的建立,进而利于植入和妊娠。巨噬细胞在母胎界面微环境的建立中起着至关重要的作用。在胚胎植入期,母胎界面巨噬细胞积聚于此,清除凋亡细胞,分泌细胞因子,诱导免疫耐受;同时,分泌血管内皮生长因子,促进母胎界面血管的形成与重塑,构建胚胎发育所需的营养物质运输的胎盘血管。此外,巨噬细胞参与卵巢黄体的形成,以保证正常雌、孕激素的分泌与运输。课题组前期研究发现,围植入期暴露于CS₂可导致孕鼠子宫组织细胞炎性因子增多以及血清雌、孕激素水平下降,提示巨噬细胞与CS₂致小鼠胚胎植入障碍过程密切相关。综上所述,植入期小鼠子宫和卵巢巨噬细胞极化和功能在CS₂暴露后发生改变可能是其胚胎植入障碍的重要机制之一。因此,本研究利用已经构建的小鼠胚胎植入障碍模型,在胚胎植入期不同时点暴露于二硫化碳后的不同时间断面上,观察小鼠卵巢和子宫组织中巨噬细胞极化和功能变化,以期揭示巨噬细胞极化和功能变化在二硫化碳致胚胎植入障碍中的作用。研究目的于小鼠受孕后植入期不同时间点暴露于CS₂建立小鼠胚胎植入障碍模型,检测不同暴露点后不同观察终点子宫组织中巨噬细胞极化变化,并测定相关因子IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa的表达;同时,检测卵巢组织中巨噬细胞极化变化,并测定相关因子TNF-α、Cox2、Hif1-α和Vegfa的表达,以期阐明巨噬细胞极化与功能改变在CS₂致小鼠胚胎植入障碍中的作用和机制。研究方法1.动物模型的建立性成熟昆明种小鼠（8-12w）适应性喂养一周后进行合笼,雌雄合笼比例为1:1。次日早晨8点检查雌性小鼠阴栓,以阴栓阳性者定义为怀孕第一天（GD1）,并随机分配到各组。模型共设3个染毒组（染毒时间点为GD3、GD4和GD5）,并在各染毒时间点后的连续时间点设置观察终点（GD4、GD5、GD6和GD7,共计13个观察终点）,每个观察终点含有12只孕鼠。染毒组以631.4mg/kg（0.4LD50）的剂量溶于橄榄油后进行腹腔注射,对照组腹腔注射等体积的橄榄油作为溶剂对照。2.样本收集与巨噬细胞极化与功能的检测于各个观察终点收集孕鼠子宫组织和卵巢组织。应用流式细胞术检测子宫内膜组织巨噬细胞极化情况（F4/80:巨噬细胞;CD16/32:M1型巨噬细胞;CD206:M2型巨噬细胞）。应用ELISA和实时荧光定量PCR的方法测定全子宫组织中IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa蛋白和mRNA的表达水平。制备卵巢组织石蜡切片,HE染色后对卵巢中的黄体进行病理分析,并对病理评价指标进行评分定量分析;同时采用免疫组化染色方法测定iNOS和Arg-1表达水平以检测卵巢黄体M1、M2巨噬细胞含量并进行定量分析。应用实时荧光定量PCR测定卵巢黄体中TNF-α、Cox2、Hif1-α以及VegfamRNA的表达水平。3.统计学分析采用Excel进行数据的录入,并应用SPSS19.0统计学分析软件进行统计学分析并以P<0.05定义为有统计学意义。将原始实验组数据除以对照组数据,使原始数据结果标准化。测量指标先进行正态性检验,正态分布指标以均数±标准差表示。各组比较之前进行方差齐性检验。若方差齐,采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,两两比较采用Dunnett T test;若方差不齐,则选用Welch检验,两两比较采用Dunnett’s T3 test。此外,应用GraphPad Prism软件绘制结果图。研究结果1.CS₂暴露对卵巢黄体结构与功能的影响围植入期暴露于CS₂后,相比于对照组,孕鼠卵巢黄体结构和功能受到不同程度的损伤。在GD4染毒GD5观察终点上,孕鼠卵巢黄体血管明显扩张与充血（P<0.05）,卵巢结构明显受损（P<0.05）。同时,Cox2和Hif1-αmRNA测定结果显示,两种细胞因子均呈现先升高后下降的趋势,其中Cox2细胞因子的mRNA在GD3染毒GD5观察终点表达水平明显升高（P<0.05）,而在GD5染毒GD7观察终点表达水平明显下降（P<0.05）;Hif1-α细胞因子的mRNA在GD3染毒GD4观察终点、GD4染毒GD5观察终点表达水平明显升高（P<0.05）,然后降至正常水平。提示,CS₂暴露可导致孕鼠黄体损伤。2.CS₂暴露对卵巢黄体巨噬细胞极化平衡的影响相比于对照组,围植入期GD3暴露组GD5观察终点M1和M2巨噬细胞数量均明显增加（M1:P<0.05;M2:P<0.01）,随后,M1型巨噬细胞降低至正常水平而M2型巨噬细胞数量在GD6观察终点明显增加（P<0.01）。同时,M2型巨噬细胞在GD7观察终点（GD4和GD5染毒）明显下降（P<0.05）。在植入窗口期,M1/M2巨噬细胞极化平衡由M1型巨噬细胞为主导（M1>M2在GD3染毒GD4观察终点,P<0.01）转变为M2型巨噬细胞为主导（M1<M2在GD5染毒GD6观察终点,P<0.01）。3.CS₂暴露对子宫内膜组织巨噬细胞极化平衡的影响围植入期GD3,GD4和GD5暴露于CS₂后,各观察终点子宫内膜M2型巨噬细胞数量明显低于对照组（在GD7观察终点P<0.01）;但M1型巨噬细胞数量于GD4染毒GD6观察终点明显升高（P<0.05）。在植入窗口期,M1/M2巨噬细胞极化平衡由M1型为主导（GD3染毒GD4观察终点,P<0.05）转变为M2型为主导（GD3染毒GD5观察终点,P<0.01）,随后又转变为M1型为主（GD3染毒GD6和GD7观察终点）。4.CS₂暴露对子宫与卵巢组织免疫因子表达水平的影响围植入期GD3暴露于CS₂后GD4观察终点,相比于对照组,子宫组织中IL-6的mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;而IL-12蛋白表达水平明显下降（GD5,P<0.01;GD7,P<0.05）。另一方面,耐受因子的分泌变化紊乱,IL-10蛋白的表达水平在GD3染毒GD4观察终点（P<0.05）和GD4染毒GD7观察终点（P<0.01）明显升高,但在GD5染毒GD6观察终点上表达水平明显降低（P<0.05）。TGF-β1蛋白表达水平在GD4和GD6观察终点明显升高（P<0.05）,其mRNA表达水平在GD7观察终点明显下降（P<0.01）。卵巢组织中,TNF-αmRNA的表达水平明显升高（GD3染毒GD4观察终点,P<0.01;GD4染毒GD7观察终点,P<0.01;GD5染毒GD6观察终点,P<0.05）。5.CS₂暴露对子宫与卵巢组织血管内皮生长因子表达水平的影响相比于对照组,围植入期GD3染毒暴露于CS₂后,子宫组织中VegfamRNA表达水平在GD4观察终点明显升高（P<0.05）而在GD6观察终点表达水平明显下降（P<0.05）;Vegfa蛋白表达水平在GD5观察终点明显下降（P<0.05）。卵巢组织中,VegfamRNA表达水平在GD4和GD7观察终点上明显升高（P<0.01）。结论1.围植入期CS₂染毒后,卵巢黄体和子宫内膜组织M1/M2巨噬细胞极化平衡显示为短时炎症状态,提示巨噬细胞通过诱导耐受以调节炎症不利于胚胎植入的状态。2.围植入期CS₂染毒后,卵巢黄体结构和功能受损,这种受损的机制可能是由于巨噬细胞极化改变所致。3.围植入期CS₂染毒后,子宫组织中耐受性因子IL-10以及TGF-β1蛋白表达水平升高,提示子宫组织旨在通过耐受性调节来保证剩余胚胎的正常植入和发育。