论文部分内容阅读
脑胶质瘤源于大脑的支持细胞即神经胶质细胞,是最常见的中枢神经系统肿瘤。它占颅内原发性脑瘤的40%左右。在美国每年大约有13000人因此病死亡,大部分的胶质瘤治疗效果不好,患者的5年生存率不足50%,其治疗不佳的主要原因是大部分的患者的耐药。脑胶质瘤在治疗时常用烷化剂类等药物,此类抗癌药物的细胞毒性作用主要是有赖于它与DNA之间形成烷基,引起DNA链内交联的能力,从而引起肿瘤细胞的凋亡。MGMT基因启动子区域特定CG位点甲基化的患者会对烷化剂药物较非甲基化患者敏感。MGMT基因启动子区域特定CG位点甲基化的患者会比非甲基化的患者的总生存期会明显的增加,因此在对患者进行药物选择时,MGMT基因启动子区域特定CG位点甲基化的检测是非常必要的。本文分别从定性及定量检测两个方面,建立了MGMT基因启动子区域特定位点甲基化检测的方法。对于定性检测,本文采用Herman建立的甲基化特异性PCR技术(Methylation Specific PCR,MSP),该方法操作简单,成本低廉。通过对PCR反应中退火温度以及PCR反应体系中所使用的酶的选择优化,本方法的灵敏度可以达到0.5%,并且在此基础上进行了稳定性试验的验证,同时对患者进行了临床检测实验的建立,形成了MGMT基因甲基化检测标准的操作规程。在此方法的基础上本文建立了基于荧光定量检测的Methylight方法,能够对甲基化程度进行定量检测,该方法最大的优势在于其高通量,且无需在PCR后电泳、杂交等操作,减少了污染和操作误差。通过对标准品的检测,结果显示本定量方法的检测的灵敏度为1%,并且通过对所配置标准品的检测实验结果看出,实验检测的数据与标准品的甲基化含量基本吻合,进一步验证了实验方法的精确性,本论文同时依据该方法的具体的操作流程对几种肿瘤细胞系的甲基化程度进行了定量检测,为后续对几种肿瘤的研究奠定了基础。原发性级别的脑胶质瘤患者其IDH1在R132位处会发生突变,同时突变型个体比野生型个体的总生存率要高,并且此位点的突变在继发性级别的脑胶质瘤中概率较高。因此,对IDH1基因突变的检测对于级别的胶质瘤是非常必要的。本文成功的运用焦磷酸测序实现了对检测IDH1基因突变的检测,可以对R132位突变位点进行定量检测,且灵敏度在5%左右,通过实时测序的原理得到DNA序列信息,不需要任何电泳或荧光标记。