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根际铜绿假单胞菌M18(Pseudomonas aeruginosa M18)能分泌藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid,PCA)等抗生素,对植物病原真菌有很强的抑制作用。前期研究显示,Plt合成存在非常复杂与独特的调控网络,其中,Las与Rhl两大菌群传感(Quorum sensing,QS)系统对Plt合成及基因表达存在强烈的抑制作用。然而,Las和Rhl对Plt合成的分子调控机制有待进一步研究。Las与Rhl系统同属LuxI/LuxR(信号分子合成酶/应答调控子)型QS系统,分别由LasI/LasR、RhlI/RhlR组成。本课题,集中探索Las与Rhl两QS系统在Plt合成调控中的分子机制以及相关性。围绕这一目标,主要开展下列三部分工作: 首先,研究Las与Rhl两大QS调控系统独自及联合对Plt合成的调控作用。运用PCR技术从 M18基因组中分别克隆出lasI、lasR、rhlI、rhlR基因,通过抗性基因插入突变及同源重组技术构建系列单、双突变体库:M18lasI、M18lasR、M18rhlI、M18rhlR、M18lasI/lasR、M18rhlI/rhlR、M18lasI/rhlI、M18lasR/rhlR八个突变株。通过发酵及HPLC技术分析两个QS系统对Plt合成的影响。结果显示,las或rhl单系统突变都会导致Plt的产量显著升高;las QS系统内单、双突变后,Plt产量无明显差异;rhl系统中rhlI基因突变株要比 M18rhlR和M18rhlI/rhlR两突变株的产量高一倍。上述结果说明,Plt合成分别受到 Las和Rhl两个系统的负调控。然而,非常有趣的是,Las和Rhl的两个QS系统的双突变株:两个信号分子合成酶基因lasI与rhlI均发生突变的M18lasI/rhlI、两个应答调控子基因lasR与rhlR均发生突变的M18lasR/rhlR,与野生型菌株相比,其Plt合成均受到显著抑制。结果暗示,同属Lux型QS系统的Las与Rhl在Plt合成调控中可能存在相互拮抗作用,Plt合成仅需要其中任意一个 QS激活,两个QS系统同时存在,会存在相互竞争拮抗作用,从而出现单个 QS系统突变导致Plt合成显著升高的现象。 其次,Plt合成操纵子pltLABCDEFG与转录激活子pltR之间(pltR-pltL)存在三个启动子pltRp、pltLp、及功能未知的pltXp,我们通过LacZ报告基因分析与EMSA实验,从这三个启动子中进一步定位了Las和Rhl两调控系统应答调控子LasR与RhlR的靶启动子。研究结果显示,在las和rhl突变株中,这三个启动子的活性都要高于野生型,其中以 pltLp表现最为明显,其次是 pltRp,而pltXp的活性相对显著性不高。据此,我们初步预测,Las和Rhl两QS系统很可能通过直接调控pltLp启动子调控Plt合成,也可能通过调控plt转录激活子pltR的启动子pltRp间接调控Plt合成。随后,通过EMSA分析,我们发现,LasR和RhlR蛋白都与启动子pltRp分别存在明显的结合作用,而与pltLp和pltXp之间不存在直接的相互作用。我们猜测Plt合成需要Las或Rhl其中一个系统的存在,但两个QS应答调控蛋白LasR、RhlR在与共同靶启动子pltRp的结合中存在相互拮抗作用。两个调控蛋白竞争性地结合pltRp启动子,从而相互消减了彼此与靶启动子的结合作用,两系统同时存在引起PltR表达下调,间接引起plt操纵子表达及Plt合成下调;而Las、Rhl分别单突变则导致Plt合成显著上升。 最后,通过信号分子添加实验可以看出,在M18lasI、M18rhlI、M18lasI/rhlI分别补充相应外源信号分子 C12-HSL、C4-HSL后,Plt合成以及菌体生长均回复到野生型水平,说明LasR、RhlR两个应答调控蛋白在参与Plt合成调控的过程中,需要相应信号分子的结合,才能发挥正常的调控功能。同样,前面实验也说明了,LasR、RhlR蛋白体外表达过程中,需要加入相应的信号分子,才能得到可溶性活性功能蛋白。