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NPR1基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。本实验以PCR方法从拟南芥中克隆到NPR1基因,通过酶切,连接等技术构建了NPR1基因的植物表达载体。并以亲本西瓜品种”昌农黑冠”为材料,研究西瓜高频再生体系的建立,农杆菌转化过程中各种参数的确定,再生植株筛选、鉴定等问题。并以西瓜子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将NPR1基因转入西瓜基因组中获得转基因再生植株;主要结果如下:
以DNA-PCR扩增的方法,从拟南芥中克隆到NPR1基因,序列分析结果表明,该基因与发表的NPR1基因序列完全相同。构建了NPR1基因的植物表达载体——pCaMVNPR,并将该表达载体导入农杆菌,获得农杆菌基因工程菌株。
在西瓜的组织培养中,不定芽的分化与外植体种类、苗龄、激素等因素密切相关。3~5日龄的子叶诱导效果最好;BA是诱导子叶芽分化的关键因素,但浓度在0.2~1.0mg/U范围内对芽分化没有明显影响。诱导培养基内添加BA即可使子叶外植体直接再生出不定芽,再生频率高,而且再生时间短,8-12天可观察到不定芽的出现。筛选出的最佳诱导培养基为:子叶:MS+BA1.0mg/L,再生频率为96%;茎尖:MS+BA0.2mg/L,再生频率为100%。西瓜根的诱导比较容易,MS基本培养基或添加少量的生长素IBA,NAA等均能诱导根的分化,最佳生根诱导培养基为1/2MS+NAA0.2+IBA0.05。
农杆菌介导的遗传转化方法研究深入,技术方法成熟,使用广泛,是双子叶植物较为理想的转化方法。介导西瓜遗传的最适宜条件为:3d苗龄的子叶预培养1d,侵染10-15min,共培养3d。非转化再生芽在含潮霉素20mg/L的MS诱导培养2~3周后,全部褪绿变枯,最后死亡。只有少数转化外植体在含潮霉素20mg/L的诱导培养基上2~3周后仍保持绿色,并分化出再生芽。把抗性芽继代到MS+BA0.2+NAA0.05的成苗培养基中培养。把1.5~2cm高的植株切下,转接到含Hy的生根培养基中进行生根筛选,但根对潮霉素等抗生素比较敏感,5mg/l的潮霉素即可抑制西瓜根的分化。
本实验共获得200多株抗性植株,对部分西瓜转化试管苗进行微量DNA提取,PCR检测12株,其中5株呈阳性,初步证明目的基因已经整合到西瓜基因组中。