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乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界范围的传染性疾病,其囊膜蛋白乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)能够诱导机体产生保护性抗体乙肝表面抗体(Hepatitis B surface antibody,HBsAb),是乙肝疫苗的主要成分。同时,HBsAg也是ELISA诊断免疫是否成功的主要试剂成分。大量制备HBsAg在预防和检测方面有重要意义。本实验开展了HBsAg的体外表达及表达后初步纯化、应用的研究工作。 从已确诊的乙肝病人血清中提取DNA,利用Primer 5.0,参照GeneBank发表的序列,设计针对编码HBsAg S基因的特异性引物。PCR扩增S基因,将其分别克隆入毕赤酵母胞内表达载体pPICZB和分泌型表达载体pPICZaA中,成功构建了重组质粒pPICZS和pPICZaS。构建的重组子经SacI线性化后,电转化入酵母菌株GS115。利用抗生素Zeocin筛选重组子,诱导表达后,进行Western-blot,ELISA鉴定。结果表明,HBsAg在毕赤酵母中得到胞内表达,未得到分泌表达。经增加抗生素Zcocin的浓度筛选出高表达的工程菌GS115-pPICZS。扩大培养后,进一步研究表明,96h为最佳收获时间,表达量达0.31g/L(40g菌体沉淀湿重)。经镍柱亲和层析纯化,得到较纯的HBsAg,其免疫原性与反应原性良好,能够成为工业化生产的优良菌株。 同时,为了提高HBsAg的表达量,将S基因克隆到原核表达载体pRSETB中,构建重组质粒pRSETBS,转入宿主菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达后,Western-blot分析,未见明显表达。推测可能是由于HBsAg的疏水性,使其即使在能够克服对细胞有毒性的大肠杆菌宿主菌中,也难得到大量表达。