大蒜(Allium Sativum)可用于各种疾病的预防和治疗,具有抑制致癌物活化、解毒、抗氧化和保护DNA损伤等功效。然而鲜大蒜的刺激性和难闻的气味限制了其药用价值,后来大蒜经高温发酵制得了老蒜(Aged Garlic),与普通生蒜相比老蒜更加安全,且可以显著降低鲜蒜的刺激性。研究发现老蒜主要含有的含硫化合物包括S-烯丙基半胱氨酸(SAC)、S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)和蒜氨酸(SACS),其中SAMC药理活性较高。SAMC在抗癌、保肝和抗慢阻肺等方面均具有显著的药理活性。目前有关SAMC的研究大多局限于抗癌活性的评价,而对其合成、代谢、抗慢阻肺机制及联合用药鲜有报道。因此本课题从合成、代谢、活性机制及联合用药几个方面对SAMC进行了初步研究。本课题的内容包括以下六个章节:第一章,首先合成了 SAMC,并对其理化性质、稳定性等进行了初步药学评价;第二章和第三章,利用多种体外模型对SAMC的代谢机制进行了研究;第四章,针对SAMC的吸收、分布、代谢和排泄等进行了体内研究,并建立了SAMC及其代谢物体内含量的测定方法;第五章,从信号通路、抗炎抗氧化及蛋白修饰的角度对SAMC抗慢阻肺的作用机制进行了研究;第六章,对其缓解抗真菌药物泊沙康唑(POS)所致不良反应的作用和机制进行了评价和分析。SAMC的初步药学评价(第一章)包括合成工艺、纯度分析、结构确证、理化性质和稳定性研究。SAMC在实体大蒜中的含量很低,提取工艺费时费力,且纯化过程复杂低效。为了得到稳定可靠的SAMC原料来源,本课题对SAMC的合成工艺进行了充分的调研,对不同路线进行了综合分析,最后采用两步的合成工艺成功制备了高纯度的SAMC原料。随后,采用UV、IR、HRMS、1W-NMR以及13C-NMR对SAMC进行了结构确证。并对SAMC的性状、熔点、不同溶剂中的溶解度、油水分配系数、解离常数、稳定性等进行了测定。结果显示,SAMC为白色或类白色片状物,熔点179.21℃(也为分解点),在水中可溶,在乙醇、丙酮、二氯甲烷等有机溶剂中几乎不溶;其油水分配系数logP小于0,属于亲水性化合物。其解离常数分别为2.7和9.1。在纯度分析和稳定性研究的过程中,我们建立了 SAMC含量体外测定的液相色谱法,并对分析方法进行了验证,实验结果表明该色谱法专属性和线性良好,准确度和精密度等均满足要求。稳定性考察结果表明,SAMC在酸性环境中的稳定性较好,但在碱性环境中极不稳定,极易降解;加速试验结果显示,SAMC在铝塑包装条件下可以室温稳定存放。SAMC体外代谢机制研究(第二章)包括肝细胞中代谢和肝微粒体中代谢两个部分。首先建立了肝细胞和肝微粒体两个体外代谢模型,并对不同模型所生成的代谢物进行了鉴定;同时考察了参与SAMC代谢的主要CYP450酶亚型及SAMC对CYP450的抑制作用;最后对其酶促动力学参数进行了测定。结果表明SAMC在肝细胞中有两个代谢物,在肝微粒体中有四个代谢物。其最佳孵育时间及蛋白浓度分别为15 min和1 mg/mL。参与SAMC代谢的主要酶亚型为CYP3A4和CYP1A1,同时SAMC对CYP2E1具有一定的抑制性。其酶促动力学结果表明Vmax和Km分别为24.29 μM/min/mg肝微粒体和339.7 μM。SAMC体外代谢机制研究(第三章)主要研究了 SAMC在血液中的代谢。首先对SAMC在血中的代谢产物进行了鉴定;其次对SAMC在血中的代谢位点进行了确定,同时研究了内源性巯基化合物对SAMC的影响;随后对SAMC的代谢机制及代谢动力学进行了研究;最后对SAMC的血浆蛋白结合及蛋白修饰进行了分析。结果表明,SAMC在血中检测到六个代谢产物,而其主要代谢蛋白为红细胞中大于30 kD的蛋白。SAMC在红细胞中代谢速率快、半衰期短,且一些含有巯基的内源性物质对SAMC的代谢具有较大的影响。蛋白结合及修饰结果表明,其血浆蛋白结合率约50%,同时SAMC可以使血红蛋白93位和125位半胱氨酸残基上游离的巯基发生烯丙基硫醇化,且多次注射给药的大鼠体内也发现了这种作用,但是相对强度较小。SAMC体内代谢研究(第四章)包括生物样品分析方法的建立和验证、代谢产物鉴定、药物代谢动力学、组织分布等研究内容。本章节首先建立了 SAMC体内含量的LC-MS分析方法和其代谢产物的GC-MS分析方法并进行了验证,同时对SAMC通过灌胃给药后的代谢、分布与排泄进行了研究。结果表明所建立的LC-MS和GC-MS两种方法专属性好,精密度高、且准确度、稳定性等符合要求。灌胃给药后,在体内未检测到SAMC原型药物,而是检测到它的两个主要的代谢产物AMSO和AMSO2。其代谢产物AMSO的最高血药浓度Cmax为134.933±32.041 μg/mL,而 AMSO2 最高血药浓度 Cmax 为 122.27±21.937 μg/mL;AMSO与AMSO2的达峰时间分别为24 h和36 h;AMSO的半衰期在12小时左右,而AMSO2的半衰期高达26 h以上。组织分布研究表明,灌胃给药后,SAMC的两个代谢物在大鼠的心、肝、脾、肺和肾中均有分布。相对于心、脾、肺和肾等组织,两个代谢物在肝组织中的浓度较高。排泄研究表明,SAMC的代谢产物可以通过尿液、粪便及胆汁排泄。为进一步了解SAMC在体内代谢的情况,采用尾静脉注射给药的方式,对其代谢动力学进行了研究。在给药剂型的制备上,加入了吐温-80,并通过高压均质机进行了处理,属于微粒体分散体系,具有了一定的缓释作用。测定结果表明,SAMC在体内的半衰期极短,不足5 min。SAMC用于治疗慢阻肺的活性机制研究(第五章)由信号通路的探索、抗炎抗氧化保护机制以及药物作用位点研究三个方面组成。(1)信号通路的研究是通过LPS诱导人体肺腺癌细胞SPC-A1建立了 COPD模型,从对粘膜蛋白MUC5AC的抑制作用和膜蛋白AQP-5的激活作用两个方面评价SAMC对SPC-A1的保护作用。ELISA实验结果表明,SAMC对LPS诱导SPC-A1中MUC5AC表达具有显著抑制作用;而RT-PCR实验结果从RNA水平进一步证明了 SAMC对LPS诱导的MUC5AC的抑制性。免疫印迹和免疫荧光的实验结果显示,SAMC能够显著抑制LPS诱导的SPC-A1中IκBα的降解及P65的核转移。综合以上结果可以看出,SAMC可以通过调节NF-κB信号通路抑制SPC-A1中MUC5AC的分泌,以达到缓解COPD的作用。(2)SAMC抗炎抗氧化的活性研究是利用所构建的巨噬细胞NR8383和SD大鼠炎症和氧化损伤模型来完成的。实验结果表明SAMC能够显著降低由LPS所诱导的巨噬细胞NR8383和大鼠肺灌洗液中TNF-α IL-1β和IL-8的水平。而氧化应激测定结果表明SAMC对于巨噬细胞中的ROS、SOD及MDA具有调节作用。同时SAMC能够降低LPS造成的大鼠肺湿重干重比率,抑制LPS诱导的大鼠肺组织中MPO和NO水平的升高。病理切片以及免疫组化的观察结果表明SAMC不仅可以抑制LPS诱导的肺部炎症,而且能够修复损伤的大鼠肺组织。免疫组化结果还显示SAMC抗炎作用可能是通过调节NF-κB来实现的,该结果与体外细胞实验一致。(3)蛋白修饰实验结果表明,SAMC可诱导MUC5AC蛋白第5564号CYS发生S-半胱氨酸化,可通过掩盖蛋白表面暴露的半胱氨酸残基,阻止蛋白之间二硫键的形成,进而改变粘蛋白的三级构像,降低粘液的粘度,使得呼吸道的粘液易于咳出,从而缓解COPD所引起的气道阻塞的症状。SAMC和抗真菌药物(泊沙康唑,POS)联合用药研究(第六章),包括SAMC对抗真菌药物不良反应的作用评价及机制研究。首先,通过喷雾干燥技术制备了 POS肠溶微球,并对其进行了表征。其次,以昆明小鼠为模型,研究了SAMC对POS所致小鼠不良反应的保护作用。研究结果表明,POS连续给药一周(100 mg/kg)小鼠出现饮食减少、懒动、倦怠、竖毛、毛无光泽,腹泻发生率达40%;而同时给予SAMC与POS组,可使精神状态明显好转,腹泻发生率降低到20%。抗炎机制研究结果表明,联合治疗组能够显著降低由POS诱导的TNF-α IL-1β及IL-6的表达水平。抗氧化机制研究结果表明,联合给药低和高剂量组均能降低由POS诱导的MDA表达水平分别约20%和30%。组织病理切片结果显示,联合给药组小鼠结肠组织相对比于POS组,炎性浸润及粘膜粘连均有一定的修复,且结肠组织结构更清晰可辨。以上结果说明SAMC可以从抗氧化抗炎方面缓解POS所致的不良反应。综上所述,本课题首先对SAMC的合成工艺、结构鉴定、理化性质和稳定性等进行了初步药学评价。随后从体内、体外两个方面对SAMC的代谢、组织分布和排泄进行了研究。接着从分子通路、抗炎抗氧化及蛋白修饰等方面对其抗慢阻肺机制进行了研究。最后对SAMC与POS联合使用时降低抗真菌药物不良反应的机理进行了分析。结果表明,SAMC具备较好的成药性,而且具备联合用药的优势。