论文部分内容阅读
目的:胆汁酸（bile acid,BA）作为一种多功能的信号分子,具有调节脂质、葡萄糖和能量代谢,是维持机体正常生理功能的重要物质。胆汁酸具有高效的肝肠循环特征,主要包括肝脏,胆囊,小肠,结肠和血浆五个部分组成。胆汁酸肝肠循环是维持机体胆酸稳态的关键因素,在正常生理状况下,胆汁酸肝肠维持恒定。然而,机体在药物和酒精等外源性物质的作用下会造成胆汁淤积,从而引发多中肝胆疾病。酒精性肝病患者时常伴有黄疸,胆汁淤积症状,因而会引起胆汁酸稳态失衡,而饮酒对胆汁酸肝肠循环稳态影响尚不清楚。近年来,饮酒与胆汁酸代谢异常已成为海内外学者研究热点。有研究表明,大鼠慢性饮酒会引起机体局部,肝脏,血浆中胆汁酸代谢发生改变;并且会改变胆酸相关合成酶和转运蛋白的基因表达水平。然而,酒精摄入对整个胆汁酸肝肠循环（肝脏、胆囊、小肠、结肠和血浆）的影响,及参与胆汁酸肝肠循环的合成酶、转运蛋白、核受体的蛋白表达水平研究尚不清楚。因此本研究课题,采用酒精灌胃的方式对雄性FVB小鼠（0%,30%和50%酒精）处理6周后,采用安捷伦液质联用仪（Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS）,分别对小鼠肝脏、胆囊、小肠、结肠和血浆中24种主要胆汁酸成分进行含量测定,以考察酒精摄入对整个胆汁酸肝肠循环中胆汁酸含量的影响。在机理研究方面,采用免疫印迹法（Western blotting,WB）,检测空白组和酒精摄入组小鼠肝脏和回肠中的胆汁酸合成酶:细胞色素P4507a1（Cholesterol 7α-hydroxylase,Cyp7a1）,细胞色素P45027a1（Sterol 12-alpha-hydroxylase,Cyp8b1）,细胞色素P4508b1（Sterol 27-hydroxylase,Cyp27a1）和胆酸辅酶A:氨基酸-N-酰基转移酶（bile acid-Co A:amino acid N-acyltransferase,Baat）;胆汁酸转运蛋白:胆汁酸盐输出泵（Bile salt export pump,Bsep）,多药耐药相关蛋白2（Multidrug resistance-associated protein 2,Mrp2）,Na+牛磺胆盐共转运体（Na+-dependent taurocholic cotransporting,Ntcp）和顶端钠依赖性胆汁酸转运体（Apical sodium dependent bile acid transporter,Asbt）;胆汁酸核受体:法尼醇X受体（Farnesoid X receptor,Fxr）和成纤维细胞生长因子15（Fibroblast growth factor 15,Fgf15）的蛋白表达水平,从蛋白表达水平阐释酒精摄入对胆汁酸肝肠循环影响的机制。随后,我们通过检测小鼠血清谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）的活力以及肝组组织病理学检查,以考察酒精摄入对小鼠肝脏的影响。在此基础上,我们研究了酒精摄入对具有显著肝肠循环代谢特征药物伊立替康（Irinotecan,CPT-11）的药代动力学的影响,为临床研究提供参考和借鉴。方法:1小鼠酒精干预实验受试动物FVB小鼠（n=55）,6-7周龄,按照体重随机分为三组:空白对照组（双蒸水）,30%酒精组（v/v）和50%酒精组（v/v）,剂量:0.1mL/10g/天,每周记录小鼠体重。连续灌胃6周后,处死小鼠,收集生物样本:胆汁、血浆、肝脏、小肠及其内容物和结肠。2胆汁酸UHPLC-MS/MS检测方法的建立采用安捷伦液质联用仪（UHPLC-MS/MS）建立小鼠胆汁酸质谱检测方法,以检测小鼠肝脏、胆囊、血浆、小肠和结肠中24种主要胆汁酸的含量。其中,游离型胆汁酸:CA（Cholic acid）,CDCA（Chenodeoxycholic acid）,DCA（Deoxycholic acid）,LCA（Lithocholic acid）,UDCA（Ursodeoxycholic acid）,HDCA（Hyodexycholic acid）,MCA（Muricholic acid）,HCA（Hyocholic acid）,αMCA（αMuricholic acid）,βMCA（βmuricholic acid）,ωMCA（ωMuricholic acid）;牛磺酸结合型胆汁酸:T-CA（Tauro-cholic acid）,T-CDCA（Tauro-chenodeoxycholic acid）,T-DCA（Tauro-deoxycholic acid）,T-LCA（Tauro-lithocholic acid）,T-UDCA（Tauro-ursodeoxycholic acid）,T-HDCA（Tauro-hyodexycholic acid）,T-αMCA（Tauro-αMuricholic acid）,T-βMCA（Tauro-βMuricholic acid）;甘氨酸结合型胆汁酸:G-CA（Glyco-cholic acid）,G-CDCA（Glycol-chenodeoxycholic acid）,G-DCA（Glyco-deoxycholic acid）,G-LCA（Glyco-lithocholic acid）,G-UDCA（Glycol-ursodeoxycholic acid）。3胆汁酸相关合成酶、转运蛋白及核受体蛋白的检测采用Western blotting方法,检测酒精摄入对胆汁酸肝肠循环中胆汁酸合成酶,转运蛋白和核受体的蛋白表达水平。其中,在肝脏中胆汁酸合成酶为:Cyp7a1,Cyp8b1、Cyp27a1和Baat,转运蛋白为:Bsep,Mrp2和Ntcp,核受体为:Fxr。同时在回肠中胆汁酸转运蛋白为:Asbt,核受体为:Fxr和Fgf15。4血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力检测按照生化分析试剂盒说明书步骤,检测酒精干预后小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活力,以考察酒精摄入对小鼠肝功能的影响。5肝组织病理学检查小鼠酒精摄入后,取一部分新鲜的肝组织于固定盒内。用4%的多聚甲醛固定48 hr后,弃多聚甲醛,更换为70%的酒精浸肝组织。采用石蜡切片技术,进行肝组织病理学检查,以考察酒精干预对小鼠肝细胞形态的影响。6 CPT-11在酒精干预小鼠体内的药代动力学研究空白对照组和50%酒精组小鼠实验前,禁食不禁水（10-12 hr）。CPT-11尾静脉注射给药5 mg/kg,每组小鼠各6只。采用肝素钠管分别于0,5,15,30,60,120,360,480,720和1440 min尾静脉采血（30-50μL）,样品置于–80°C保存直至分析。结果:1酒精摄入增加了小鼠肝肠循环中的胆汁酸总量1.1酒精摄入增加了BA pool（bile acid pool）与空白组小鼠作对照,30%和50%酒精摄入后,小鼠的BA pool分别显著增加了1.9和3.7倍（P<0.05）。1.2酒精摄入增加了小鼠肝脏中的胆汁酸含量在肝脏,以空白组作对照,50%酒精后单个游离型胆汁酸成分,CA、αMCA、βMCA、ωMCA、MCA、HCA、DCA、CDCA、HDCA、UDCA和LCA分别显著增加了2.5、4.9、4.4、3.2、3.9、4.5、2.6、2.6、2.4、3.6和1.8倍（P<0.05）;单个牛磺酸结合型胆汁酸成分,T-CA、T-?MCA、T-βMCA、T-DCA和T-CDCA分别显著增加了5.0、5.5、10.5、4.5和37.4倍（P<0.05）;单个甘氨酸结合型胆汁酸成分,G-CA和G-CDCA分别显著增加了6.8和1.8倍（P<0.05）。我们考察了三种形式总胆汁酸,游离型总胆汁酸、牛磺酸结合总胆汁酸和甘氨酸结合总胆汁酸在50%酒精组中分别显著增加了3.7,7.2和2.7倍（P<0.05）,而牛磺酸结合总胆汁酸仅在30%酒精组显著增加了3.5倍（P<0.05）。此外,肝脏中总胆汁酸在30%和50%酒精组分别显著增加了2.0和4.7倍（P<0.05）。1.3酒精摄入增加了小鼠胆囊中的胆汁酸含量在胆囊,与空白组小鼠比较,30%酒精摄入后单个胆汁酸成分,βMCA、ωMCA、HCA和G-CA分别显著增加了3.7、4.8、2.7和3.0倍（P<0.05）。然而50%酒精摄入后,单个游离型胆汁酸成分,CA、αMCA、βMCA、ωMCA和HCA分别显著增加了11.5、5.0、5.3、5.7和3.9倍（P<0.05）;单个牛磺酸结合型胆汁酸成分,T-αMCA、T-βMCA、T-DCA、T-CDCA、T-HDCA、T-UDCA和T-LCA分别显著增加了1.8、1.8、2.0、2.0、1.8、2.4和2.5倍（P<0.05）;单个甘氨酸结合型胆汁酸成分,G-CA和G-CDCA分别显著增加了3.6和5.7倍（P<0.05）。我们考察了三种形式总胆汁酸,游离型和甘氨酸结合型总胆汁酸在30%酒精组分别显著增加了3.2和2.7倍（P<0.05）,而在50%酒精组,游离型总胆汁酸、牛磺酸结合型总胆汁酸和甘氨酸结合型总胆汁酸分别显著增加了4.3、1.5和2.9倍（P<0.05）。此外,胆囊中总胆汁酸在30%和50%酒精组分别显著增加了1.5和1.8倍（P<0.05）。1.4酒精摄入增加了小鼠小肠中的胆汁酸含量在小肠,与空白组小鼠比较,50%酒精摄入后单个游离胆汁酸成分,CA、αMCA、βMCA、ωMCA、MCA、HCA、DCA、CDCA和UDCA分别显著增加了2.7、2.5、6.0、2.5、4.1、1.9、1.6、1.5和4.8（P<0.05）倍;单个牛磺酸结合型胆汁酸成分,T-CA、T-βMCA、T-DCA、T-CDCA、T-UDCA和T-HDCA分别显著增加了2.5、3.5、5.7、2.8、3.3和3.3倍（P<0.05）;甘氨酸结合型胆汁酸G-UDCA和G-DCA分别显著增加了2.8和2.7倍（P<0.05）。我们考察了三种形式总胆汁酸,游离型总胆汁酸、牛磺酸结合型总胆汁酸和甘氨酸结合型总胆汁酸,在50%酒精组中分别显著增加了3.0、2.9和1.8倍（P<0.05）,而在30%酒精摄入组无显著改变（P>0.05）。此外,小肠的总胆汁酸在50%酒精组显著增加了2.9倍（P<0.05）,然而30%酒精组无显著变化（P>0.05）。1.5酒精摄入增加了小鼠结肠中的胆汁酸含量在结肠,与空白组比较,50%酒精摄入后单个游离胆汁酸成分,CA、βMCA、ωMCA、MCA、DCA、CDCA、HDCA、UDCA和LCA,分别显著增加了3.1、2.5、2.5、1.7、1.7、2.2、2.2、和1.6倍（P<0.05）;单个牛磺酸结合胆汁酸成分,T-αMCA、T-βMCA、T-DCA、T-UDCA和T-HDCA分别显著增加了2.6、1.8、2.6、2.8和2.8倍（P<0.05）;甘氨酸结合胆汁酸G-CA在30%和50%酒精组分别增加了1.9和2.8倍（P<0.05）。我们考察了三种形式总胆汁酸,游离型总胆汁酸、牛磺酸结合型总胆汁酸和甘氨酸结合型总胆汁酸,在50%酒精组中分别显著增加了1.6,1.7和2.8倍（P<0.05）,而30%酒精组无显著变化（P>0.05）。另外,结肠中总胆汁酸在50%酒精组显著增加了1.7倍（P<0.05）,而在30%酒精摄入组无显著变化（P>0.05）。1.6酒精摄入增加了小鼠血浆中的胆汁酸含量在血浆,以空白组作对照,50%酒精摄入后单个游离型胆汁酸成分,CA、βMCA、ωMCA、MCA、DCA和CDCA分别增加了3.5、2.3、3.9、7.0、1.8和1.9倍（P<0.05）;单个牛磺酸结合胆汁酸成分,T-CA、T-αMCA、T-βMCA、T-DCA、T-CDCA、THDCA和T-UDCA分别显著增加了3.6、7.1、5.1、3.6、2.7和2.5倍（P<0.05）;甘氨酸结合型胆汁酸G-CA增加了8.2倍（P<0.05）。我们考察了三种形式总胆汁酸,游离型总胆汁酸、牛磺酸结合型总胆汁酸和甘氨酸结合型总胆汁酸,在50%酒精组中分别显著增加了2.6、4.8和4.7倍（P<0.05）,而在30%酒精组无显著变化（P>0.05）。此外,血浆中总胆汁酸,在50%酒精组显著增加了5.0倍（P<0.05）,而30%酒精组无显著变化（P>0.05）。2酒精摄入改变了肝肠循环中胆汁酸合成酶,转运白和核受体的表达水平2.1酒精摄入上调了胆汁酸合成酶的蛋白表达水平与空白对照组比较,肝脏中胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1和Cyp27a1的蛋白表达水平,在30%酒精组分别显著上调了3.2、2.9和2.8倍（P<0.05）,而在50%酒精组分别显著上调了5.3、3.7和3.5倍（P<0.05）。Baat的蛋白表达水平,经50%酒精处理后显著上调了1.6倍（P<0.05）,而在30%酒精组无显著统计学意义（P>0.05）。2.2酒精摄入改变了胆汁酸转运蛋白及核受体的蛋白表达水平与空白对照组比较,小鼠肝脏中胆汁酸外排转运蛋白Bsep和Mrp2的蛋白表达水平,经30%酒精摄入后显著上调1.8和2.4倍（P<0.05）,经50%酒精摄入分别显著上调了1.7和3.2倍（P<0.05）。肝脏中胆汁酸摄入蛋白Ntcp的蛋白表达水平,经30%和50%酒精干预后分别显著下调了1.5和4.5倍（P<0.05）。肝脏中核受体Fxr的蛋白表达水平,经30%和50%酒精干预后均无显著统计学差异（P>0.05）。此外,小鼠回肠中胆汁酸摄取转运蛋白Asbt的蛋白表达水平,经30%和50%酒精干预后分别显著上调1.8和4.5倍（P<0.05）。回肠中胆汁酸核受体Fxr蛋白表达水平显著下调1.6倍（P<0.05）,而在30%酒精组无显著统计学意义（P>0.05）。3酒精摄入引起小鼠肝脏损伤酒精摄入后,与空白组小鼠比较,30%酒精组和50%酒精组小鼠体重于3-6周明显下降。ALT和AST酶活力,在30%酒精组小鼠血清中分别显著上升2.4倍和3.1倍（P<0.05）,且50%酒精组分别显著上升2.4倍和3.5倍（P<0.05）。小鼠肝组织病理学检查结果显示,30%酒精组小鼠肝组织病理学无明显变化,而50%酒精组小鼠肝组织同时存在脂肪变性、肝细胞气球样变和中性粒细胞的炎性浸润,说明酒精摄入导致了小鼠酒精性肝脏损伤。4酒精摄入改变了小鼠体内CPT-11的药代动力学尾静脉注射给药CPT-11（5 mg/kg）,与对照组相比50%酒精组小鼠血浆中,CPT-11和SN38（7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin）的最大血药浓度(Cmax)分别显著下降了53%和25%（P<0.05）,药时曲线下面积AUC0-t分别显著下降了57%和37%,清除率（CL）分别显著增加了158%和45%（P<0.05）。SN38-G（7-ethyl-10-hydroxycamptothecin glucuronide）的药动学参数(AUC0-t（t=24 hr）、CL和Cmax)无显著统计学差异（P>0.05）。结果表明,酒精摄入改变了CPT-11及其代谢物SN38的药代动力参数。结论:酒精摄入通过上调胆汁酸合成酶（Cyp7a1、Cyp27a1、Cyp8b1和Baat）和外排转运蛋白（Bsep和Mrp2）以及回肠中转入蛋白Asbt的表达水平,同时下调肝脏中转入蛋白Ntcp和回肠中胆汁酸核受体Fxr的表达水平,使整个胆汁酸肝肠循环系统（肝脏、胆囊、血浆、小肠和结肠）中胆汁酸总量增加而淤积。此外,酒精摄入显著降低了肝肠循环显著的药物伊立替康的AUC值。论文研究结果可为合理消费酒精提供一定的依据。