【摘 要】
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山药（Dioscorea opposite Thunb.）是历史悠久的食药两用植物资源,其最重要的活性成分之一是山药多糖,具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤和降血糖等多种生物活性,因此很有必要对其进行深入的研究。硫酸化修饰可以提高天然多糖的生物活性,常用来对多糖进行改性。目前对山药多糖生物活性的研究大多基于天然多糖,鲜少研究其改性后的生物活性,因此本论文以江西瑞昌产区的山药为研究对象,从中提取精制山药多
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81960708）
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山药（Dioscorea opposite Thunb.）是历史悠久的食药两用植物资源,其最重要的活性成分之一是山药多糖,具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤和降血糖等多种生物活性,因此很有必要对其进行深入的研究。硫酸化修饰可以提高天然多糖的生物活性,常用来对多糖进行改性。目前对山药多糖生物活性的研究大多基于天然多糖,鲜少研究其改性后的生物活性,因此本论文以江西瑞昌产区的山药为研究对象,从中提取精制山药多糖,命名为CYP,并对CYP进行硫酸化修饰获得山药多糖的硫酸化衍生物,命名为S-CYP。对以上两种山药多糖的理化性质进行分析,通过体外RAW264.7巨噬细胞模型探究硫酸化山药多糖免疫调节活性,并通过RNA-seq技术筛选S-CYP处理RAW264.7巨噬细胞的转录组信息。基于RNA-seq的结果,进一步探讨S-CYP对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节活性的作用机制。主要研究内容与结果如下:1.研究了硫酸化修饰对CYP理化特性的影响,并以RAW264.7巨噬细胞为模型,探究了硫酸化修饰对其免疫调节活性的影响。硫酸化修饰可以增加CYP的分子量,通过红外光谱图也证实硫酸基团结合到CYP的结构中,并测得S-CYP的取代度为0.44。CYP的中性糖为35.17±0.09%,糖醛酸为33.40±3.2%,蛋白质为2.87±0.17%;S-CYP的中性糖为33.27±0.04%,糖醛酸为21.90±2.15%,蛋白质为2.87±0.10%。单糖组成结果表明硫酸化修饰改变了单糖组成的比例,但是没有改变其种类;扫描电镜图表明S-CYP多呈细小碎片状,表面更分散卷曲。S-CYP处理可以上调RAW264.7巨噬细胞中i NOS的表达,诱导NO的产生;同时也可以诱导RAW264.7巨噬细胞分泌ROS、TNF-α和IL-6。2.基于RNA-seq技术深入研究S-CYP对RAW264.7细胞的免疫调节作用基因表达的影响,通过其中基因组变化的信息探讨了S-CYP对RAW264.7细胞的免疫调节作用机制。通过RNA-seq分析S-CYP处理RAW264.7巨噬细胞所获得的转录信息,筛选出的1764个差异基因中上调基因401个,下调基因1363个。GO富集分析提示S-CYP对RAW264.7巨噬细胞的刺激可以与信号转导的调节、细胞表面受体信号通路、细胞对化学刺激的反应等方面相关;KEGG富集分析提示S-CYP对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节活性与MAPK信号通路、细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、NF-kappa B信号通路等通路相关。3.基于TLR4-MAPK/NF-κB信号通路探究了S-CYP对巨噬细胞免疫功能的作用机制。S-CYP可以通过TLR4-MAPK/NF-κB信号通路调节RAW264.7巨噬细胞的分泌细胞因子（TNF-α和IL-6）。S-CYP的处理可以上调TLR4和MAPK三个亚基（ERK、JNK、p38）的蛋白表达水平,免疫荧光实验表明S-CYP的处理可以促进NF-κB p65亚基向细胞核转运。进一步的添加TLR4、MAPK三个亚基（ERK、JNK、p38）和NF-κB的特异性抑制剂处理RAW264.7巨噬细胞,S-CYP刺激产生的细胞因子（TNF-α和IL-6）的分泌被显著抑制。4.在以上研究的基础上,以山药多糖为原料,开发了山药多糖口服液产品。通过单因素实验和响应面优化山药多糖口服液的配方,得到其最佳工艺条件为:山药多糖15 mg/m L,白砂糖3%,蜂蜜3%,柠檬酸0.12%。对口服液的影响大小依次为山药多糖添加量＞蜂蜜添加量＞柠檬酸添加量＞白砂糖胶添加量,为山药资源高值化利用提供技术支撑。
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